NK4增強肝癌細胞Li-7對5-FU的敏感性及其作用機制的研究.pdf

1、目的：
　　探索HGF對肝癌細胞Li-7增殖能力、5-FU敏感性的影響。嘗試利用HGF拮抗劑-NK4增強 Li-7細胞在HGF存在的情況下對5-FU的敏感性，并與PI3K靶向型抑制劑LY294002比較增敏效果，同時探索NK4影響Li-7對藥物敏感性可能的分子機制。
　　方法：
　　1.提取并純化質(zhì)粒pcDNA3.1-NK4、pcDNA3.1。脂質(zhì)體包裹實驗檢測脂質(zhì)體與質(zhì)粒最優(yōu)轉(zhuǎn)染比例。
　　2.將 pcDNA3

2、.1-NK4和 pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染至 Li-7細胞中，逆轉(zhuǎn)錄 PCR鑒定NK4表達水平。
　　3. MTT法檢測不同濃度 HGF對 Li-7細胞增殖的影響，驗證 Li-7對5-FU的敏感性是否會受到HGF的影響。
　　4.倒置顯微鏡下觀察HGF對Li-7形態(tài)的影響。
　　5. MTT法分別檢測：在 HGF、5-FU的干預下，未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、NK4轉(zhuǎn)染組的Li-7細胞存活率的差異；LY294002是否可以逆

3、轉(zhuǎn)HGF誘導Li-7產(chǎn)生的5-FU耐受；LY294002對5-FU抑制 HL7702、Li-7、 SW480、HepG2增殖的影響；LY294002對多種濃度的5-FU抑制 Li-7增殖的影響； LY294002、 PD98059、5-FU對Li-7增殖的影響。
　　6.流式細胞術(shù)檢測NK4、HGF、LY294002對5-FU誘導Li-7凋亡的影響。
　　7. Western blot檢測各組細胞中Akt、p-Akt、Bcl

4、-2等蛋白的表達差異。
　　結(jié)果：
　　1.在不同濃度（0，0.2，2，20ng/ml）HGF的刺激下肝癌細胞 Li-7的存活率沒有發(fā)生顯著變化（P>0.05），但是當 HGF濃度達到20ng/ml時能夠顯著降低5-FU誘導的增殖抑制（P<0.01）。
　　2.在 HGF的刺激下，Li-7細胞形態(tài)由不規(guī)則形變?yōu)楠M長形，細胞邊緣變得更加清晰，且隨HGF濃度升高形態(tài)變化越來越明顯。
　　3.將質(zhì)粒pcDNA3.1-N

5、K4、pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染至Li-7細胞中，RT-PCR鑒定結(jié)果為NK4表達成功。
　　4.在HGF（20ng/ml）與不同濃度的5-FU（0，12.5，25，50μg/ml）的干預下，轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-NK4的 Li-7細胞與轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1的細胞相比細胞存活率都明顯降低（P<0.05）。
　　5.流式細胞術(shù)結(jié)果顯示在接受相同濃度的 HGF（20ng/ml）與5-FU（50μg/ml）處理后，轉(zhuǎn)染 pcDN

6、A3.1-NK4的 Li-7細胞的凋亡率明顯低于轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1的細胞（P<0.05）。
　　6. Western blotting結(jié)果顯示 NK4可以抑制 HGF（20ng/ml）誘導的 Akt的磷酸化，降低Bcl-2的表達（P<0.05）。
　　7. LY294002（10μg/ml）并沒有促進5-FU（50μg/ml）對 Li-7細胞的殺傷，反而在不同濃度（0.2，2，20ng/ml） HGF干預下，細胞存活率分

7、別提升13.1％、19.7%、7.7%（P<0.05）。
　　8.與單獨使用5-FU相比，LY294002（10μg/ml）、5-FU（50μg/ml）共同處理可以顯著降低 SW480、HepG2細胞的存活率（P<0.01、P<0.05）；恰恰相反的是，與單獨使用5-FU相比，LY294002、5-FU共同處理提高了Li-7存活率（P<0.05）；單獨使用5-FU處理或LY294002、5-FU共同處理HL7702細胞，細胞存活率

8、并沒有明顯的差異（P>0.05）。
　　9. LY294002在5-FU濃度較低（5μg/ml）時，降低了 Li-7細胞的存活率（P<0.01）；在5-FU濃度逐漸升高（達到50μg/ml）后，LY294002又提高了細胞存活率（P<0.01）。
　　10. LY294002（10μg/ml）、PD98059（20μg/ml）、5-FU（50μg/ml）共同處理Li-7細胞與 LY294002、5-FU處理細胞相比，細胞存活

9、率沒有明顯差異（P>0.05）。
　　11.流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，LY294002（10μg/ml）、5-FU（50μg/ml）共同處理與5-FU（50μg/ml）單獨處理Li-7細胞相比細胞凋亡率明顯下降（P<0.05）。
　　12. Western blotting結(jié)果顯示 LY294002處理 Li-7后，細胞中 Akt的磷酸化程度、Bcl-2的表達量明顯降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. NK4能

10、夠抑制HGF對Li-7細胞的刺激，增強5-FU對Li-7的增殖抑制作用，提高凋亡率。
　　2.產(chǎn)生這種抑制效果的原因可能是 NK4抑制了 HGF誘導的 Akt的磷酸化，降低了Bcl-2的表達。
　　3.進一步證實了在5-FU對Li-7的細胞毒性作用較強時，雖然LY294002能夠阻斷 PI3K/Akt信號通路，降低 Bcl-2的表達，但是它提高了細胞存活率、降低了凋亡率，而這種作用不是通過激活Raf/Erk信號通路實現(xiàn)的。<