siRNA沉默HLA-E基因增強(qiáng)肝癌細(xì)胞NK敏感性.pdf

1、目的：研究小分子干擾RNA(siRNA)特異性抑制人肝癌Hep G2細(xì)胞外源性綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)的可行性，并定量分析siRNA基因沉默的效率，為后續(xù)可能的基因治療提供參考。 探討干擾素Y(IFN-Y)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系BEL-7402表達(dá)非經(jīng)典人類白細(xì)胞抗原I類分子(HLA-E)，及其對(duì)NK細(xì)胞毒性作用的影響。 同時(shí)觀察肝癌患者癌組織、遠(yuǎn)處硬化組織中經(jīng)典HLA-I(HLA-ABC)、HLA-E、抗原提呈

2、輔助分子(B2微球蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)抗原相關(guān)蛋白TAP)表達(dá)水平，及判斷肝癌肝移植手術(shù)預(yù)后的可行性及其價(jià)值。 針對(duì)HLA-E mRNA靶序列中不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)、合成多個(gè)siRNA鏈，定量分析它們對(duì)HLA-E(+)的肝癌BET7402細(xì)胞的基因沉默效率，篩選最佳抑制效果的siRNA。 方法:凝膠電泳觀察siRNA體外含10％血清或空白細(xì)胞培養(yǎng)液孵育12h后的降解性。利用熒光標(biāo)記示蹤技術(shù)，觀察紅色熒光(Cy3)標(biāo)記siRNA經(jīng)脂質(zhì)體Li

3、pofectamin 2000轉(zhuǎn)染HepG2的轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)變化。同時(shí)將報(bào)告基因(GFP)表達(dá)質(zhì)粒、相關(guān)的siRNA經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamin 2000瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞技術(shù)、Western雜交、實(shí)時(shí)定量PCR等，分析特異性GFP siRNA抑制報(bào)告基因48h后的表達(dá)。 采用不同濃度IFN-Y(0、100、200、400、500、600、800、1000 IU/ml)分別體外持續(xù)誘導(dǎo)人肝

4、癌7402細(xì)胞72h，用細(xì)胞免疫組化、Western-bolt、逆轉(zhuǎn)錄PCR半定量、流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)各組細(xì)胞HLA-E基因的表達(dá)情況。觀察各組HLA-E表達(dá)水平對(duì)其NK細(xì)胞殺傷率的影響。 回顧性研究40例肝癌肝移植患者，利用免疫組化法檢測(cè)其原發(fā)癌灶和遠(yuǎn)處硬化組織中經(jīng)典HLA-I(HLA-ABC)、HLA-E、微球蛋白(β2～M)、抗原轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白(TAP)的抗原表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)石蠟病理組縱中HLA-E mRNA表達(dá)。將

5、HLA及相關(guān)分子的表達(dá)情況與患者臨床資料、預(yù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 用IFN-y(500 TU/ml)誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞表達(dá)HLA-E基因，通過(guò)流式細(xì)胞分選純化，作為研究靶細(xì)胞。根據(jù)HLA-E mRNA序列不同位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出3種特異性HLA-E siRNA鏈(A、B、C)并人工合成。將3種siRNA(100umol/L)分別經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染至HLA-E陽(yáng)性的BEL-7402細(xì)胞。采用細(xì)胞免疫熒光、流

6、式細(xì)胞技術(shù)、Western雜交、實(shí)時(shí)PCR等定量方法，比較48h后不同的siRNA沉默HLA-E基因的效果，并觀察肝癌細(xì)胞的HLA-E基因沉默對(duì)其NK細(xì)胞殺傷率的影響。 結(jié)論: GFP siRNA能特異性沉默HepG2細(xì)胞外源性報(bào)告基因GFP的瞬時(shí)表達(dá)，體外細(xì)胞siRNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率為90％，siRNA沉默效率為80％。 IFN-γ誘導(dǎo)肝癌BEL-7402細(xì)胞HLA-E基因表達(dá)，并通過(guò)非經(jīng)典HLA-I途徑逃避免疫細(xì)胞監(jiān)