巴弗洛霉素A1對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用及增強(qiáng)其對(duì)5-氟尿嘧啶敏感性的研究.pdf

1、目的：
　　驗(yàn)證5-氟尿嘧啶（5-FU）可誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性自噬，觀察自噬抑制劑巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A1）對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞自噬水平的影響，初步探討改變自噬水平對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力和對(duì)5-FU敏感性的影響。
　　方法：
　　1、分別以含0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0ug/mL5-FU的RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清）培養(yǎng)胃

2、癌SGC-7901細(xì)胞24、48h，應(yīng)用MTT法檢測(cè)5-FU對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞細(xì)胞增殖能力的影響。
　　2、以含1.25ug/mL5-FU的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌SGC-7901細(xì)胞0、3、6、12、24、48h，應(yīng)用 MTT法檢測(cè)胃癌 SGC-7901細(xì)胞細(xì)胞增殖能力的變化，應(yīng)用蛋白質(zhì)印記法（Western Blot）檢測(cè)5-FU對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞自噬及凋亡蛋白表達(dá)的影響。
　　3、將細(xì)胞分為

3、4個(gè)組：對(duì)照組（以不含干預(yù)藥物的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）以下簡(jiǎn)稱(chēng) Cnotrol組；Bafilomycin A1組（以含100nMBafilomycin A1的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）以下簡(jiǎn)稱(chēng)BAF組；5-氟尿嘧啶組（以含1.25ug/mL5-FU的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）以下簡(jiǎn)稱(chēng)5-FU組和5-氟尿嘧啶+Bafilomycin A1組（以含有100nMBafilomycin A1和1.25ug/mL5-F

4、U的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）以下簡(jiǎn)稱(chēng)5+B組。應(yīng)用掃描電鏡、免疫組化及Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞自噬水平變化，應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、5-FU對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力抑制具有時(shí)間（0-48h）、濃度（0-10ug/mL）依賴(lài)性，當(dāng)5-FU濃度為1.

5、25 ug/mL，作用時(shí)間為24h時(shí)胃癌細(xì)胞增殖能力顯著低于對(duì)照組（RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h）（P=0.000），5-FU作用時(shí)間為48h時(shí)胃癌細(xì)胞增殖能力顯著低于對(duì)照組（RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h）（P=0.000）。
　　2、當(dāng)5-FU濃度為1.25 ug/mL，作用時(shí)間為48h，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)自噬相關(guān)蛋白Beclin1相對(duì)表達(dá)量（0-24h）逐漸增高，到達(dá)24h出現(xiàn)高峰后逐漸降低；LC3Ⅱ/Ⅰ相

6、對(duì)表達(dá)量（0-48h）逐漸增多；P62相對(duì)表達(dá)量（0-12h）逐漸增高，12h到達(dá)高峰后逐漸降低；凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)量（0-6h）逐漸升高，6h到達(dá)高峰后逐漸降低,Bcl-2相對(duì)表達(dá)量（0-48h）逐漸增高，Bcl-2/Bax比值12h開(kāi)始高于對(duì)照組。
　　3、當(dāng)100nMBafilomycin A1聯(lián)合1.25ug/mL5-FU作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞24h，掃描電鏡見(jiàn)5+B組與5-FU組相比自噬體大量堆積，自噬溶酶體

7、顯著減少；免疫組化見(jiàn) Beclin1平均光密度5+B組低于5-FU組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；Western Blot見(jiàn)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ∕Ⅰ相對(duì)表達(dá)量5+B組高于5-FU組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；P62相對(duì)表達(dá)量5+B組高于5-FU組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；MTT法見(jiàn)細(xì)胞增殖能力5+B組低于5-FU組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）；遷移實(shí)驗(yàn)見(jiàn)遷移細(xì)胞5+B組少于5-FU組，差別具

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；侵襲實(shí)驗(yàn)見(jiàn)侵襲細(xì)胞數(shù)5+B組（51.00±5.83個(gè)/視野）少于5-FU組（103.33±4.53個(gè)/視野），差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）；凋亡率5+B組高于5-FU組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；Western Blot見(jiàn)促凋亡蛋白Bax相對(duì)表達(dá)量5+B組高于5-FU組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；抗凋亡蛋白 Bcl-2相對(duì)表達(dá)量5+B組低于5-FU組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

9、=0.000），Bcl-2/Bax比值5+B組低于5-FU組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）。
　　4、當(dāng)100nMBafilomycin A1作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞24h，掃描電鏡見(jiàn)BAF組與 Control組相比自噬體堆積，自噬溶酶體減少；免疫組化見(jiàn) Beclin1平均光密度BAF組顯著低于Control組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008）；Western Blot見(jiàn)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ∕Ⅰ相對(duì)表達(dá)量BAF組

10、高于Control組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；P62相對(duì)表達(dá)量 BAF組高于 Control組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；MTT法見(jiàn)細(xì)胞增殖能力BAF組低于Control組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；遷移實(shí)驗(yàn)見(jiàn)遷移細(xì)胞數(shù) BAF組少于 Control組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；侵襲實(shí)驗(yàn)見(jiàn)侵襲細(xì)胞數(shù) BAF組少于 Control組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；凋亡率BAF組高于

11、Control組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；Western Blot見(jiàn)促凋亡蛋白Bax相對(duì)表達(dá)量BAF組高于Control組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005）；抗凋亡蛋白Bcl-2相對(duì)表達(dá)量BAF組低于Control組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.046），Bcl-2/Bax比值BAF組低于Control組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。
　　結(jié)論：
　　1、5-FU可誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞產(chǎn)生