ebv-miR-BHRF1-1通過抑制p53調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞中EBV感染狀態(tài)的分子機(jī)制研究.pdf

1、miRNA(microRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長約22nt的非編碼小RNA分子。在胞漿內(nèi)與特定蛋白形成微核酸蛋白復(fù)合體(miRNPs，micro-ribonucleouproteins)，通過對靶基因mRNA的序列特異性裂解、抑制翻譯的起始或延長、降解多聚腺苷酸尾或者介導(dǎo)肽鏈水解等機(jī)制在翻譯水平抑制其靶基因的表達(dá)。但是，人們對miRNA在形成蛋白復(fù)合體并靶向調(diào)節(jié)基因的過程中的具體機(jī)制，仍然知之甚少。miRNAs廣泛存在于從病毒到高等多

2、細(xì)胞生物，目前采用生物信息學(xué)預(yù)測，在低等多細(xì)胞動物和植物中存在一兩百條miRNAs，而在人類可能存在至少一千條。對miRNAs功能的研究提示幾乎參與所有細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程的調(diào)節(jié)，在包括腫瘤在內(nèi)的人類所有病理過程中都能觀察到其表達(dá)的異常。這一發(fā)現(xiàn)與生物信息學(xué)所預(yù)測的，哺乳動物中約30％蛋白編碼基因受到miRNAs的調(diào)節(jié)相一致。 病毒在感染宿主細(xì)胞后，需要調(diào)節(jié)自身和宿主兩方面的基因表達(dá)，使其自身存在得以維持和復(fù)制，潛伏感染以維持自身存在，部

3、分進(jìn)入復(fù)制周期以使自身繁殖擴(kuò)增，兩者之間的平衡，避免了自身過多復(fù)制引起宿主細(xì)胞的死亡。這種平衡對病毒來說很重要。多數(shù)病毒也能編碼miRNAs并廣泛參與病毒與宿主的相互作用。EB病毒是人類皰疹病毒，與包括鼻咽癌在內(nèi)的多種人類疾病密切相關(guān)。該病毒目前發(fā)現(xiàn)編碼至少32條miRNAs，據(jù)其在基因組中的位置分為兩組：BHRF1組和BART組。其中BHRF1組位于病毒復(fù)制早期基因BHRF1內(nèi)，BART組則位于病毒潛伏期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物BART內(nèi)。BART組

4、miRNA已證實可以抑制病毒復(fù)制，維持其較低的復(fù)制水平。BHRF1組在病毒裂解復(fù)制水平增高時表達(dá)增加，提示其與病毒裂解復(fù)制的調(diào)控相關(guān)。但是，生物信息學(xué)分析并沒有發(fā)現(xiàn)BHRF1組miRNA在病毒裂解復(fù)制期基因中存在作用位點，只有ebv-miR-BHRF1-1在人p53mRNA 3'-非編碼區(qū)(3'-LITR，3'-Untranslated regions)存在兩個作用靶位點。 P53是重要的抑癌基因，在多種腫瘤中存在突變。但是，在

5、鼻咽癌中p53基因的突變頻率很低(<10％)，并出現(xiàn)了p53蛋白積聚現(xiàn)象。作為調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡的重要基因，多數(shù)病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自身復(fù)制時，需要通過不同的途徑來抑制p53的功能，來使宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境處于類S期，并抑制細(xì)胞的凋亡，為病毒自身復(fù)制提供原料和贏得時間。而且研究發(fā)現(xiàn)，EB病毒裂解復(fù)制立刻早期基因蛋白Zta，作為病毒裂解復(fù)制的開關(guān)基因，在病毒進(jìn)入裂解復(fù)制周期時可以和p53結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄激活功能。說明EB病毒在復(fù)制過程中

6、同樣需要抑制p53的功能以為其自身復(fù)制提供有利條件。那么野生型p53蛋白在鼻咽癌中的積聚，可能在鼻咽癌中EB病毒低水平復(fù)制的維持中具有重要意義。 由此，我們推測：EBV編碼的ebv-miR-BHRF1-1可能通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞相關(guān)基因p53的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)p53與Zta相互作用而參與調(diào)節(jié)EBV潛伏與裂解兩種狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。 我們采用TPA誘導(dǎo)SUNE1內(nèi)病毒裂解復(fù)制水平增高后，采用RT-PCR方法證實在病毒裂解復(fù)制水平增高后，

7、ebv-miR-BHRF1-1的表達(dá)也隨之上調(diào)，而p53蛋白水平和下游基因mdm2水平隨之下調(diào)，同時細(xì)胞周期檢測證實S期細(xì)胞增加而凋亡細(xì)胞減少，ebv-miR-BHRF1-1的上調(diào)與p53的下調(diào)及功能受抑有利于病毒復(fù)制，且兩者之間存在聯(lián)系。 然后，我們采用反義RNA特異性抑制ebv-miR-BRHRF1-1之后，再以TPA處理SLINE1，發(fā)現(xiàn)病毒裂解復(fù)制早期蛋白Zta和Ea-D上調(diào)幅度減小，說明裂解復(fù)制水平提高的幅度減小，而p

8、53蛋白水平和mdm2水平的下調(diào)也減弱，mdm2水平甚至得到逆轉(zhuǎn)，說明p53功能的受抑制程度也得到了逆轉(zhuǎn)。 接下來，我們構(gòu)建ebv-miR-BHRE1-1的過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染SUNE1細(xì)胞，觀察GFP蛋白表達(dá)證實轉(zhuǎn)染效率，以RT-PCR檢測證實成熟ebv-miR-BHRF1-1得到表達(dá)，再檢測病毒復(fù)制早期蛋白Zta和Ea-D水平以及p53蛋白和mdm2蛋白水平，比較對病毒復(fù)制水平的影響和對p53的抑制作用。發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)ebv-mi

9、R-BHRF1-1后，病毒裂解復(fù)制水平提高而p53蛋白水平和功能受到了抑制。 以上研究結(jié)果表明，EB病毒編碼的miR-BHRF1-1通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞相關(guān)基因p53的表達(dá)參與病毒裂解復(fù)制的調(diào)節(jié)，初步闡明EBV編碼的miR-BHRF1-1參與調(diào)節(jié)EBV兩種感染狀態(tài)的平衡以及維持EBV的持續(xù)存在中的作用機(jī)制。為EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生機(jī)制提供新的理論依據(jù)，并為以EBV編碼的miRNAs為切入點治療EBV相關(guān)腫瘤的實驗研究提供新的理論和實驗