ebv-miR-BHRF1-1通過抑制p53調節(jié)鼻咽癌細胞中EBV感染狀態(tài)的分子機制研究.pdf

1、miRNA(microRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長約22nt的非編碼小RNA分子。在胞漿內與特定蛋白形成微核酸蛋白復合體(miRNPs，micro-ribonucleouproteins)，通過對靶基因mRNA的序列特異性裂解、抑制翻譯的起始或延長、降解多聚腺苷酸尾或者介導肽鏈水解等機制在翻譯水平抑制其靶基因的表達。但是，人們對miRNA在形成蛋白復合體并靶向調節(jié)基因的過程中的具體機制，仍然知之甚少。miRNAs廣泛存在于從病毒到高等多

2、細胞生物，目前采用生物信息學預測，在低等多細胞動物和植物中存在一兩百條miRNAs，而在人類可能存在至少一千條。對miRNAs功能的研究提示幾乎參與所有細胞內進程的調節(jié)，在包括腫瘤在內的人類所有病理過程中都能觀察到其表達的異常。這一發(fā)現(xiàn)與生物信息學所預測的，哺乳動物中約30％蛋白編碼基因受到miRNAs的調節(jié)相一致。 病毒在感染宿主細胞后，需要調節(jié)自身和宿主兩方面的基因表達，使其自身存在得以維持和復制，潛伏感染以維持自身存在，部

3、分進入復制周期以使自身繁殖擴增，兩者之間的平衡，避免了自身過多復制引起宿主細胞的死亡。這種平衡對病毒來說很重要。多數(shù)病毒也能編碼miRNAs并廣泛參與病毒與宿主的相互作用。EB病毒是人類皰疹病毒，與包括鼻咽癌在內的多種人類疾病密切相關。該病毒目前發(fā)現(xiàn)編碼至少32條miRNAs，據(jù)其在基因組中的位置分為兩組：BHRF1組和BART組。其中BHRF1組位于病毒復制早期基因BHRF1內，BART組則位于病毒潛伏期轉錄產物BART內。BART組

4、miRNA已證實可以抑制病毒復制，維持其較低的復制水平。BHRF1組在病毒裂解復制水平增高時表達增加，提示其與病毒裂解復制的調控相關。但是，生物信息學分析并沒有發(fā)現(xiàn)BHRF1組miRNA在病毒裂解復制期基因中存在作用位點，只有ebv-miR-BHRF1-1在人p53mRNA 3'-非編碼區(qū)(3'-LITR，3'-Untranslated regions)存在兩個作用靶位點。 P53是重要的抑癌基因，在多種腫瘤中存在突變。但是，在

5、鼻咽癌中p53基因的突變頻率很低(<10％)，并出現(xiàn)了p53蛋白積聚現(xiàn)象。作為調節(jié)細胞周期進程和細胞凋亡的重要基因，多數(shù)病毒在宿主細胞內進行自身復制時，需要通過不同的途徑來抑制p53的功能，來使宿主細胞內環(huán)境處于類S期，并抑制細胞的凋亡，為病毒自身復制提供原料和贏得時間。而且研究發(fā)現(xiàn)，EB病毒裂解復制立刻早期基因蛋白Zta，作為病毒裂解復制的開關基因，在病毒進入裂解復制周期時可以和p53結合，抑制其轉錄激活功能。說明EB病毒在復制過程中

6、同樣需要抑制p53的功能以為其自身復制提供有利條件。那么野生型p53蛋白在鼻咽癌中的積聚，可能在鼻咽癌中EB病毒低水平復制的維持中具有重要意義。 由此，我們推測：EBV編碼的ebv-miR-BHRF1-1可能通過調節(jié)宿主細胞相關基因p53的表達，進而調節(jié)p53與Zta相互作用而參與調節(jié)EBV潛伏與裂解兩種狀態(tài)的轉換。 我們采用TPA誘導SUNE1內病毒裂解復制水平增高后，采用RT-PCR方法證實在病毒裂解復制水平增高后，

7、ebv-miR-BHRF1-1的表達也隨之上調，而p53蛋白水平和下游基因mdm2水平隨之下調，同時細胞周期檢測證實S期細胞增加而凋亡細胞減少，ebv-miR-BHRF1-1的上調與p53的下調及功能受抑有利于病毒復制，且兩者之間存在聯(lián)系。 然后，我們采用反義RNA特異性抑制ebv-miR-BRHRF1-1之后，再以TPA處理SLINE1，發(fā)現(xiàn)病毒裂解復制早期蛋白Zta和Ea-D上調幅度減小，說明裂解復制水平提高的幅度減小，而p

8、53蛋白水平和mdm2水平的下調也減弱，mdm2水平甚至得到逆轉，說明p53功能的受抑制程度也得到了逆轉。 接下來，我們構建ebv-miR-BHRE1-1的過表達載體，轉染SUNE1細胞，觀察GFP蛋白表達證實轉染效率，以RT-PCR檢測證實成熟ebv-miR-BHRF1-1得到表達，再檢測病毒復制早期蛋白Zta和Ea-D水平以及p53蛋白和mdm2蛋白水平，比較對病毒復制水平的影響和對p53的抑制作用。發(fā)現(xiàn)在過表達ebv-mi

9、R-BHRF1-1后，病毒裂解復制水平提高而p53蛋白水平和功能受到了抑制。 以上研究結果表明，EB病毒編碼的miR-BHRF1-1通過調節(jié)宿主細胞相關基因p53的表達參與病毒裂解復制的調節(jié)，初步闡明EBV編碼的miR-BHRF1-1參與調節(jié)EBV兩種感染狀態(tài)的平衡以及維持EBV的持續(xù)存在中的作用機制。為EBV相關腫瘤的發(fā)生機制提供新的理論依據(jù)，并為以EBV編碼的miRNAs為切入點治療EBV相關腫瘤的實驗研究提供新的理論和實驗