siRNAs干擾EBNA1對EBV的陽性鼻咽癌細胞活力影響及其機制探討.pdf

1、目的：EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一種常見的人類γ-皰疹病毒,與一系列的人類惡性腫瘤相關,包括鼻咽癌。EB病毒在其感染的腫瘤細胞中呈潛伏性感染,在細胞核外以環(huán)狀游離體(episome)的形式存在,并表達病毒潛伏基因。EB病毒編碼的核抗原1(EBNA1)是唯一在所有感染細胞中持續(xù)表達的病毒蛋白。EBNA1在EB病毒的潛伏感染中起著重要作用,包括EB病毒基因組的復制和有絲分裂分離以及對其他病毒潛伏基因的轉錄激活

2、。C666-1細胞系來源于未分化的鼻咽癌(NPC),是唯一持續(xù)攜帶EB病毒的鼻咽癌細胞系,表達了EB病毒編碼的小RNA(EBERs)、EBNA1蛋白和潛伏膜相關蛋白(LMP)轉錄本。該細胞系攜帶了EBV-1基因組,具有羧基末端30bp堿基缺失的LMP1基因和V-val亞型的EBNA1基因。C666-1細胞系與中國華南地區(qū)常見的鼻咽癌異常相似,是鼻咽癌與EB病毒關系研究中重要而有力的工具。本課題目的在于利用RNA干擾技術抑制C666-1細

3、胞中EBNA1的表達,研究EBNA1在鼻咽癌發(fā)病過程中的作用。
　　 方法：設計了4條針對V-val型EBNA1編碼區(qū)的siRNAs并轉染C666-1細胞；采用Western blot證實了能有效抑制EBNA1表達的干擾序列；甲基噻唑基四唑(MTT)活力實驗檢測EBNA1干擾后C666-1細胞活力的變化,并利用2,7二氯熒光素二脂(DCFDA)探討了細胞活力變化與活性氧(ROS)之間的關系；同時利用實時定量PCR芯片技術探索了和

4、氧化應激與抗氧化相關基因的轉錄普變化,并通過RT-PCR和western blot進行了驗證。
　　 結果：Western blot證實了2條干擾序列EBNA1-1414和EBNA1-1437能有效抑制EBNA1表達；干擾EBNA1后C666-1細胞活力較對照組降低,同時細胞內活性氧產生增加；PCR芯片實驗發(fā)現干擾EBNA1后花生四烯酸鹽12-脂氧合酶(ALOXl2)基因蛋白表達有下調,谷胱甘肽還原酶(GSR)和過氧化物酶3(P