統(tǒng)合分析方法探討EB病毒相關(guān)的鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化機(jī)制.pdf

1、鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)是一種來源于鼻咽部上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，死亡率在癌癥中排第8位。好發(fā)于中國和東南亞地區(qū)，80％的NPC發(fā)生在我國，發(fā)病率居世界之首。NPC的發(fā)病具有地方性和種族特異性，目前研究表明NPC的發(fā)生與飲食習(xí)慣、環(huán)境因素、遺傳易感性和EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)感染相關(guān)。研究表明，大部分低分化鱗癌和幾乎所有未分化鱗癌均可發(fā)現(xiàn)EBV感染。 EBV屬皰疹

2、病毒科γ亞型，主要含線性雙鏈DNA，約172,000堿基，由末端重復(fù)序列、單一序列和內(nèi)部重復(fù)序列組成。約有84個(gè)ORFs，編碼80余種蛋白，大多數(shù)基因產(chǎn)物與病毒復(fù)制相關(guān)。EBV生活周期分為潛伏期、立早期、早期和晚期，不同階段表達(dá)不同的蛋白質(zhì)，發(fā)揮不同的作用。BKRF1基因編碼的EBV核抗原(EBV’snucleicantigene，EBVNA)1是維持潛伏狀態(tài)的必須蛋白；BNLF1編碼的潛伏膜蛋白1(latentmembraneprot

3、ein1，LMP1)是唯一具有瘤功能的蛋白；由BZLF1基因編碼的Z蛋白(Zebra)是病毒進(jìn)入裂解狀態(tài)的重要蛋白。 LMP1主要通過NF-κB、AP-1以及JAK／STAT等信號(hào)途徑發(fā)揮作用，抑制B淋巴細(xì)胞程序性死亡、增強(qiáng)癌基因bcl-2的表達(dá)、并不斷刺激細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)的傳遞，使細(xì)胞的生長(zhǎng)失去控制，無限增殖并向惡性轉(zhuǎn)化。Z蛋白在EBV從潛伏周期進(jìn)入繁殖(裂解)周期的過程中起關(guān)鍵作用，為病毒的復(fù)制、晚期結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)打下基礎(chǔ)。裂解

4、復(fù)制可阻遏細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。 隨著人類基因組測(cè)序計(jì)劃的完成，大量微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)的積累，以及應(yīng)運(yùn)而生的生物信息學(xué)的發(fā)展給腫瘤分子發(fā)病機(jī)理的研究開闊了新的研究思路、開辟了新的道路。生物信息學(xué)是一門由計(jì)算機(jī)技術(shù)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、數(shù)學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、信息學(xué)、生物物理和化學(xué)等結(jié)合的交叉學(xué)科。一般意義上，生物信息學(xué)是研究生物信息的采集、處理、存儲(chǔ)、傳播、分析和解釋等各方面的一門學(xué)科，它通過綜合利用生物學(xué)、計(jì)算機(jī)

5、科學(xué)和信息技術(shù)來揭示大量而復(fù)雜的生物數(shù)據(jù)所賦有的生物學(xué)奧秘。它的研究重點(diǎn)主要體現(xiàn)在基因組學(xué)(Genomics)和蛋白組學(xué)(Proteomics)兩方面。通過對(duì)DNA序列的統(tǒng)計(jì)計(jì)算分析，更加深入地理解DNA序列、結(jié)構(gòu)、演化及其與生物功能之間的關(guān)系，以揭示基因組信息結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及遺傳語言的根本規(guī)律。以生物芯片為研究基礎(chǔ)，以序列比對(duì)、統(tǒng)計(jì)分析方法、可視化作圖、生物聚類、通路分析及啟動(dòng)子預(yù)測(cè)等方法為手段，在分子水平進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘、對(duì)疾病進(jìn)行闡述。

6、利用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析腫瘤相關(guān)基因及調(diào)控機(jī)制，是當(dāng)前功能基因組學(xué)的重要研究途徑，可從整體的、基因組水平上闡明腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。最近，綜合使用各種分析手段對(duì)芯片表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的統(tǒng)合分析方法(meta-analysis)成為研究者們的熱點(diǎn)，這種分析方法不僅降低了錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(falsediscoveryrate，F(xiàn)DR)，還克服了單個(gè)芯片數(shù)據(jù)或單個(gè)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)存在的缺陷，從而更加全面地從整體上對(duì)疾病進(jìn)行研究。

7、 本研究以EBV感染NPC的三組數(shù)據(jù)(GSE2370，GSE2371，GSE6472)和EBV感染原發(fā)性滲出性淋巴瘤(primaryeffusionlymphoma，PEL)的數(shù)據(jù)(GSE2149)為分析材料，采用GeneSpring軟件篩選EBV復(fù)發(fā)感染NPC芯片數(shù)據(jù)的靶標(biāo)基因，BRBArrayTools軟件篩選EBV+／EBV--NPC和EBV+/EBV--PEL芯片數(shù)據(jù)的差異基因，再結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(Transcri

8、ptionalfactorbindingsite，TFBS)預(yù)測(cè)、文獻(xiàn)挖掘、基因組織選擇性分析和基因亞細(xì)胞定位等方法對(duì)目標(biāo)基因及其相互作用關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，從中發(fā)現(xiàn)鼻咽癌發(fā)病相關(guān)基因，構(gòu)建差異基因相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖譜并提出假說，為EBV+-NPC的分子發(fā)病機(jī)制、藥物研發(fā)及治療等更深入的課題提供有意義的探索和依據(jù)。主要分為以下三部分： 第一部分：EBV活化復(fù)發(fā)感染對(duì)NPC基因表達(dá)模式的影響。以EBV原發(fā)感染NPC的兩組芯片數(shù)據(jù)(GSE2

9、370：EBV--NPC／正常鼻粘膜上皮組織；GSE2371:EBV+／EBV--NPC)和EBV不同活化次數(shù)NPC的芯片數(shù)據(jù)(GSE6472：P1/R1／P15／R15)為研究材料，導(dǎo)入GeneSpringGX軟件篩選差異基因，然后交叉比較三組數(shù)據(jù)，得到不同活化次數(shù)的NPC差異基因。利用生物學(xué)功能聚類、KEGG通路分析、功能注釋和TFBS預(yù)測(cè)等方法對(duì)差異基因進(jìn)行生物學(xué)分析和網(wǎng)絡(luò)圖譜的構(gòu)建。結(jié)果篩選到87個(gè)EBV感染時(shí)的靶標(biāo)基因和116

10、個(gè)復(fù)發(fā)感染時(shí)的差異基因，交叉比較后，獲得23個(gè)差異基因(meta-A)在兩組數(shù)據(jù)中共同表達(dá)，作為EBV活化時(shí)復(fù)發(fā)感染的靶標(biāo)基因，可能通過兩種表達(dá)模式(expressionpatterns)發(fā)揮作用：一條主要涉及TOP1，DUSP1，DUSP6和RPS28等，另一條是由PITX1，CD9,HOXA9和IMPDH2組成的轉(zhuǎn)錄相關(guān)環(huán)。 第二部分：以EBV+／EBV--NPC(GSE2371)和EBV+／EBV-PEL(GSE2149)

11、兩組數(shù)據(jù)為分析材料研究EBV感染導(dǎo)致不同腫瘤的共同發(fā)生通路。同樣是EBV感染，最后可能發(fā)生不同的腫瘤，交叉比較這些數(shù)據(jù)，可能獲得EBV感染致腫瘤的一條共同通路，有助于理解EBV感染致鼻咽癌的發(fā)生機(jī)制。從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫下載數(shù)據(jù)后，將其導(dǎo)入至BRB-ArrayTools分析軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及差異基因的篩選和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，交叉比較兩組差異基因，結(jié)果獲得了45個(gè)侯選基因(meta-B)。對(duì)meta-B基因進(jìn)行生物學(xué)功能聚類、通路分析、TFB

12、S預(yù)測(cè)等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)meta-B基因主要涉及LMP1調(diào)節(jié)的AP-1，NF-κB和JAK／STAT三條信號(hào)通路，細(xì)胞周期及BZLF1誘導(dǎo)通路，RB／E2F，CDKN1A，DEK和P53的表達(dá)改變，可能參與EBV相關(guān)的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程。 第三部分：構(gòu)建EBV感染相關(guān)的NPC的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖譜，并提出假說。結(jié)合以上兩部分的結(jié)果，將兩個(gè)圖譜中的重要節(jié)點(diǎn)如：DEK，E2F，RB，LMP1，BZLF1，JUN，NF-κB和MYC等進(jìn)行反復(fù)的

13、文獻(xiàn)挖掘，并交叉比較淋巴結(jié)組織選擇性基因及基因亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EBV感染相關(guān)的分子作用通路根源于LMP1和BZLF1。由PITX1，CD9，HOXA9和IMPDH2組成的轉(zhuǎn)錄相關(guān)環(huán)可以通過SP1，STAT3相互聯(lián)系，BZLF1誘導(dǎo)的RB，E2F和DEK表達(dá)改變可能是腫瘤發(fā)生的一重要調(diào)節(jié)通路。綜合文獻(xiàn)挖掘的結(jié)果，我們提出EBV感染相關(guān)鼻咽癌發(fā)生機(jī)制的假說：EBV潛伏感染時(shí)，LMP1等占主導(dǎo)的作用，刺激細(xì)胞增長(zhǎng)、抑制凋亡、阻止裂解復(fù)

14、制。EBV活化時(shí)，多種因素(P53過表達(dá)，γ射線等)可誘導(dǎo)BZLF1表達(dá)，高表達(dá)的BZLF1通過CDKN1A和P27抑制CDK2的表達(dá)，低磷酸化RB／E2F復(fù)合物不能釋放出E2F，DEK表達(dá)下降，激活P53的活性，使細(xì)胞進(jìn)入裂解復(fù)制、釋放出大量的病毒粒子，進(jìn)而感染更多的宿主細(xì)胞，使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化及侵襲能力增強(qiáng)，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡和腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。 綜上所述，統(tǒng)合分析的生物信息學(xué)方法成功地對(duì)EBV相關(guān)的四組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析和研究，

15、篩選獲得了兩組特征性差異基因(包括meta-A：EBV原發(fā)感染和復(fù)發(fā)感染NPC的差異基因；和meta-B：在EBV依賴的NPC和PEL中同時(shí)差異表達(dá)基因)，并在此基因及轉(zhuǎn)錄因子基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個(gè)EBV感染相關(guān)的鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)圖譜。進(jìn)一步探討了EBV感染相關(guān)腫瘤的可能目標(biāo)基因及其相互調(diào)節(jié)關(guān)系，并提出了EBV活化復(fù)發(fā)感染致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的假說：NPC的形成和發(fā)展可能依賴從潛伏進(jìn)入裂解周期時(shí)DEK，CDK，P53，RB和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等的