脫氧核酶的可視化篩選及其抑制鼻咽癌EBV-LMP1基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、鼻咽癌是我國高發(fā)腫瘤，國內(nèi)外一系列研究證明EB病毒編碼的LMPl對(duì)其發(fā)生發(fā)展中起重要作用，被認(rèn)為是鼻咽癌的癌基因。目前，脫氧核酶是基因治療的一種嶄新的分子生物學(xué)工具，能夠?qū)NA分子在未配對(duì)的嘌呤和配對(duì)的嘧啶之間切斷，從而調(diào)控基因的表達(dá)。本研究針對(duì)LMPlmRNA設(shè)計(jì)合成10-23型脫氧核酶(10-23DRz)，觀察其在細(xì)胞內(nèi)外篩選的差異性及其抑制鼻咽癌EBV-LMPl基因表達(dá)的效應(yīng)。希望建立一個(gè)脫氧核酶簡(jiǎn)便可行的的熒光可視化篩選方法，

2、并為鼻咽癌的預(yù)防和臨床治療開創(chuàng)一個(gè)新的方法。 目的： 1、調(diào)查研究我國西部重慶地區(qū)鼻咽癌患者及非鼻咽癌對(duì)照者外周血血漿中EB病毒LMPl基因攜帶情況及LMPl基因C端30個(gè)堿基缺失和N端XhoI酶切位點(diǎn)缺失變異情況。為進(jìn)一步探討具有缺失型LMPl的EBV與鼻咽癌的相關(guān)性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2、選擇EBV-LMPl基因?yàn)槊撗鹾嗣钢委煴茄拾┑陌谢?，針?duì)EBV-LMPlmRNA設(shè)計(jì)合成多種10-23DRz，并對(duì)其轉(zhuǎn)染效率

3、及其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。 3、通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)，經(jīng)細(xì)胞外分子水平切割篩選具有高效性和特異性的脫氧核酶，并觀察RNA堿基長(zhǎng)度對(duì)脫氧核酶體外剪切效率的影響。為探索脫氧核酶細(xì)胞外分子水平切割篩選的優(yōu)化體系提供參考。 4、構(gòu)建EBV-LMPl綠色熒光融合真核表達(dá)載體，在鼻咽癌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)EBV-LMPl增強(qiáng)型綠色熒光融合蛋白表達(dá)。 5、在已建立的熒光可視化細(xì)胞平臺(tái)上，從細(xì)胞水平再次篩選高效性和特異性的脫氧核酶；并觀

4、察脫氧核酶抑制細(xì)胞內(nèi)EBV-LMPl基因表達(dá)情況及對(duì)癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。希望建立一個(gè)脫氧核酶簡(jiǎn)便可行的的熒光可視化篩選方法，并為研究脫氧核酶在體內(nèi)水平的治療應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 方法： 1、對(duì)48例鼻咽癌患者和40例非鼻咽癌對(duì)照者的外周血血漿進(jìn)行DNA抽提，分別對(duì)LMPlC端和N端進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過PAGE膠電泳、限制性酶切、序列測(cè)定等來分析LMPlC端有無30個(gè)堿基的缺失及N端有無XhoI酶切位點(diǎn)的缺失變異。

5、 2、以B95—8來源的LMPlmRNA為基礎(chǔ)，應(yīng)用RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件模擬預(yù)測(cè)LMPlmRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，選擇具有高度特異性和高度保守性的環(huán)狀膨出核苷酸序列為脫氧核酶結(jié)合靶序列，選擇AU為切割靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)10-23DRz及其對(duì)應(yīng)的的突變體和反義寡聚核苷酸；將脫氧核酶5’端用FITC標(biāo)記來檢測(cè)脫氧核酶的轉(zhuǎn)染效率及其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況；將脫氧核酶?jìng)?cè)臂及寡聚核苷酸兩端各2個(gè)堿基進(jìn)行硫代修飾來增加它們的穩(wěn)定性。 3、從B95—8細(xì)

6、胞中提取總RNA及基因組DNA，分別通過RT-PCR及PCR擴(kuò)增LMPlcDNA及DNA片段，構(gòu)建重組T載體pMDl8-T-LMPlm和pMDl8-T-LMPId；再以重組T載體為模板，PCR擴(kuò)增LMPl相關(guān)片段，構(gòu)建重組體外轉(zhuǎn)錄載體pGEM一1lzf-LMPlm、pGEM一11zf-LMPla、pGEM一1lzf-LMPlc；將重組體外轉(zhuǎn)錄載體線形化后，用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)轉(zhuǎn)錄出LMPlmRNA；模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件，用設(shè)計(jì)的侯選脫氧核酶在細(xì)胞

7、外分子水平對(duì)轉(zhuǎn)錄出的3種RNA模板進(jìn)行剪切篩選，分析剪切效率，篩選出高效率的脫氧核酶；同時(shí)與突變體和反義寡聚核苷酸進(jìn)行切割對(duì)比、與長(zhǎng)短不同的RNA模板進(jìn)行切割對(duì)比來分析脫氧核酶的特異性。 4、以重組T載體為模板，PCR擴(kuò)增LMPl相關(guān)片段，構(gòu)建LMPl增強(qiáng)型綠色熒光融合蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-N1一LMPlm、pEGFP—C1一LMPlm、pEGFP-N1一LMPla、pEGFP-Cl—LMPlc，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將它們轉(zhuǎn)入鼻

8、咽癌低分化CNE2細(xì)胞，在活細(xì)胞狀態(tài)下用熒光倒置顯微鏡觀察融合蛋白熒光表達(dá)及亞細(xì)胞分布情況；用RT-PCR及westernblot檢測(cè)來驗(yàn)~j[LMPl熒光融合真核表達(dá)是否成功。5、將FITC標(biāo)記的脫氧核酶，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入鼻咽癌細(xì)胞CNE2中，應(yīng)用熒光顯微鏡檢測(cè)脫氧核酶在細(xì)胞中的分布定位，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脫氧核酶在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，用MTT法檢測(cè)脫氧核酶的細(xì)胞毒性作用；利用已建立的熒光可視化細(xì)胞平臺(tái)，將脫氧核酶與重組熒光融合真核表

9、達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入鼻咽癌CNE2細(xì)胞，在活細(xì)胞狀態(tài)下用熒光顯微鏡直接觀察熒光融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)量差異，用Image-ProPlus軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，計(jì)算熒光表達(dá)抑制率，用SPSS11．O軟件統(tǒng)計(jì)分析，在細(xì)胞水平來篩選高效性和特異性的脫氧核酶，并與細(xì)胞外分子水平篩選結(jié)果相比較；將篩選出的高效特異的脫氧核酶與載體pEGFP-C1一LMPlm共轉(zhuǎn)染入鼻咽癌CNE2細(xì)胞，通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)脫氧核酶對(duì)LMPl熒光融合蛋白表達(dá)量的

10、影響，用MTT法檢測(cè)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)影響，用AO／EB法檢測(cè)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響，用RT-PCR檢測(cè)脫氧核酶對(duì)LMPl基因在mRNA水平的抑制作用，用westernblot檢測(cè)脫氧核酶對(duì)LMPl基因在蛋白質(zhì)水平的抑制作用。 結(jié)果： 1、48例NPC患者EBV-LMPl檢出率為100％，40例非鼻咽癌對(duì)照者EBV-LMPl檢出率為95％。鼻咽癌患者及非鼻咽癌對(duì)照者中均未發(fā)現(xiàn)C端30bp的缺失和N端XhoI酶切位點(diǎn)缺

11、失變異。 2、針對(duì)LMPlmRNA共設(shè)計(jì)出7種脫氧核酶，其中針對(duì)exonamRNA有DZl67、DZl93、DZ211共3種，針對(duì)exoncmRNA有DZ509、DZ827、DZ893、DZl037共4種；同時(shí)設(shè)計(jì)了DZ509的突變體mut-DZ509及其反義寡聚核苷酸ASODN509和熒光標(biāo)記的FITC-DZ509；所有脫氧核酶兩端各2個(gè)堿基進(jìn)行了硫代修飾。 3、(1)成功構(gòu)建重組T載體pMDl8-T-LMPlm和pM

12、Dl8-T-LMPld及重組體外轉(zhuǎn)錄載體pGEM—11zf-LMPlm、pGEM一11zf-LMPla、pGEM-11zf-LMPlc；(2)細(xì)胞外分子水平剪切篩選結(jié)果：對(duì)模板LMPlexonamRNA剪切率DZl67>DZl93>DZ211；對(duì)模板LMPlexoncmRNA剪切率DZ509>DZ893~DZl037>DZ827，同時(shí)DZ509>mut-DZ509>ASODN509；DZ509對(duì)exonamRNA無剪切活性，DZl67對(duì)

13、exoncmRNA無剪切活性；DZ509和DZl67對(duì)全長(zhǎng)LMPlmRNA都有剪切活性，但剪切率較單純外顯子mRNA剪切率更低。 4、成功構(gòu)建LMPl綠色熒光融合蛋白真核表達(dá)重組載體pEGFP-N1一LMPlm、pEGFP-C1一LMPlm、pEGFP-N1一LMPla、pEGFP-C1．LMPlc；重組載體轉(zhuǎn)入CNE2細(xì)胞后可見熒光融合蛋白主要分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，部分呈顆粒狀；用RT-PCR檢測(cè)和westernblot檢測(cè)表

14、明LMPl融合蛋白表達(dá)成功。 結(jié)論： l、我國西部重慶地區(qū)鼻咽癌和非鼻咽癌對(duì)照者血漿中攜帶的EB病毒LMPl基因C端不存在30bp缺失，N端不存在XhoI酶切位點(diǎn)缺失變異，與我國鼻咽癌高發(fā)區(qū)廣東地區(qū)和我國低發(fā)區(qū)東北地區(qū)健康攜帶者外周血攜帶的EB病毒LMPl基因相似。因此，我們認(rèn)為缺失型EB病毒并沒有選擇性地感染鼻咽癌病人，EB病毒LMPl基因N端和C端的缺失突變，可能是在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中產(chǎn)生的，并不是先有缺失突變，

15、再選擇性地感染鼻咽癌病人。至于LMPlC端30bp缺失和N端XhoI酶切位點(diǎn)缺失變異與鼻咽癌的相關(guān)性還需進(jìn)一步研究。 2、細(xì)胞外分子水平篩選結(jié)果表明DZl67和DZ509切割LMPlmRNA具有高效性和序列特異性。脫氧核酶對(duì)長(zhǎng)度不同的mRNA的剪切效率有差異。為更好的反應(yīng)實(shí)際剪切效率，我們認(rèn)為最好用全長(zhǎng)mRNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、靶點(diǎn)選擇及細(xì)胞外分子水平剪切篩選。這為探索脫氧核酶細(xì)胞外分子水平切割篩選的優(yōu)化體系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。重組

16、體外轉(zhuǎn)錄載體還可進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄出標(biāo)記RNA，這為L(zhǎng)MPl的Northernblot或Southernblot等檢測(cè)研究奠定了基礎(chǔ)。 3、利用熒光融合表達(dá)技術(shù)，我們實(shí)現(xiàn)了LMPl蛋白的N端部分、C端部分、及全長(zhǎng)蛋白在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中熒光融合表達(dá)，建立了LMPl熒光可視化鼻咽癌細(xì)胞平臺(tái)。為針對(duì)LMPl的脫氧核酶在細(xì)胞水平的篩選實(shí)現(xiàn)熒光可視化成為可能，并為觀察脫氧核酶抑制鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)EBV-LMPl基因表達(dá)情況及對(duì)癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)奠

17、定了細(xì)胞基礎(chǔ)，并有希望用G418篩壓整合，建立EBV-LMPl增強(qiáng)型綠色熒光融合蛋白長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞株。同時(shí)為進(jìn)一步研究LMPl蛋白質(zhì)的亞結(jié)構(gòu)功能提供了研究平臺(tái)。 4、脫氧核酶可經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)入鼻咽癌細(xì)胞，有一定的劑量依賴關(guān)系，分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，對(duì)靶細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性，具有潛在的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。 5、細(xì)胞內(nèi)水平熒光可視化篩選結(jié)果表明DZl67和DZ509抑制LMPl基因熒光融合表達(dá)具有高效性和特異性，與細(xì)