SCFβTrCP介導(dǎo)DYRK1A降解對細(xì)胞周期的調(diào)控與DYRK1A對AML細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究.pdf

1、文章內(nèi)容分為兩部分進(jìn)行闡述
　　第一部分 E3泛素連接酶SCFβTrCP介導(dǎo)的DYRK1A蛋白降解對細(xì)胞周期的調(diào)控作用
　　研究目的：
　　研究DYRK1A和βTrCP在細(xì)胞周期中的表達(dá)和變化規(guī)律，確定SCFβTrCP介導(dǎo)DYRK1A降解的分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.研究DYRK1A是否通過泛素-蛋白酶體途徑降解:向Hek293中轉(zhuǎn)染DYRK1A表達(dá)質(zhì)粒pDYRK1A-flag-myc，用系列濃度的

2、Lac(lactacystin)處理24小時或用2.0μMLac處理不同時間，western blot檢測DYRK1A蛋白含量，或用CHX chase assay檢測DYRK1A降解速率的變化;將pDYRK1A-flag-myc和泛素的表達(dá)質(zhì)粒pUbi-his共轉(zhuǎn)染入Hek293細(xì)胞，通過co-IP實(shí)驗(yàn)，分別以泛素抗體或flag抗體和protein A/G富集蛋白，檢測被泛素化的DYRK1A蛋白;
　　2.研究E3泛素連接酶SCF

3、βTrCP是否參與DYRK1A的降解過程:將pDYRK1A-flag-myc與βTrCP的表達(dá)載體pβTrCP-flag共轉(zhuǎn)染至Hek293細(xì)胞，通過co-IP實(shí)驗(yàn)檢測二者是否存在相互作用;合成βTrCP的siRNA干擾片段，將其與pDYRK1A-flag-myc共轉(zhuǎn)染至Hek293細(xì)胞，western blot檢測DYRK1A蛋白含量;構(gòu)建Cullin1和Cullin2的負(fù)顯性抑制載體（SCFβTrCP的競爭性抑制因子），分別將其與p

4、DYRK1A-flag-myc共轉(zhuǎn)染至Hek293細(xì)胞，western blot檢測DYRK1A蛋白含量;構(gòu)建敲除βTrCP的Hek293細(xì)胞系，通過CHX chase assay檢測DYRK1A半衰期的變化;將βTrCP的干擾片段或pβTrCP-flag分別與pDYRK1A-flag-myc共轉(zhuǎn)染至Hek293細(xì)胞，通過co-IP實(shí)驗(yàn)檢測DYRK1A泛素化水平的變化。
　　3.確定導(dǎo)致DYRK1A降解的蛋白結(jié)構(gòu)域:構(gòu)建一系列DY

5、RK1A的截短突變體，通過CHX chase assay比較各突變體的半衰期與野生型DYRK1A的區(qū)別。
　　4.確定DYRK1A蛋白中與βTrCP結(jié)合的氨基酸序列:將DYRK1A的截短突變體與pβTrCP-flag轉(zhuǎn)染至Hek293細(xì)胞中，co-IP檢測突變體與βTrCP的相互作用;構(gòu)建DYRK1A蛋白N端的截短突變體，通過co-IP實(shí)驗(yàn)檢測其泛素化水平的變化，通過CHXchase assay檢測其半衰期的變化。
　　研究

6、結(jié)果：
　　1.DYRK1A通過泛素-蛋白酶體途徑降解:用Lac處理Hek293細(xì)胞后，DYRK1A的蛋白水平隨藥物濃度及作用時間的增加而升高，其降解速率明顯變慢;在co-IP實(shí)驗(yàn)中，無論是用泛素抗體或flag抗體用做IP抗體，均能檢測到被泛素化的DYRK1A。
　　2.E3泛素連接酶SCFβTrCP參與DYRK1A的降解過程:通過co-IP實(shí)驗(yàn)，證明了DYRK1A和βTrCP之間存在相互作用;當(dāng)Hek293細(xì)胞內(nèi)的βTrC

7、P被敲除時，細(xì)胞內(nèi)DYRK1A的蛋白含量增加，半衰期變長;Cullin1和Cullin2的負(fù)顯性抑制載體能明顯增加Hek293細(xì)胞內(nèi)DYRK1A的蛋白水平;當(dāng)在Hek293細(xì)胞內(nèi)敲除或高表達(dá)βTrCP時，DYRK1A的泛素化水平分別明顯下降和升高。
　　3.DYRK1A蛋白的N端決定DYRK1A降解:通過CHX chase assay我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)截掉DYRK1A蛋白的PEST富集區(qū)、C端或只保留C端時，其降解速率與全長DYRK1A蛋

8、白沒有明顯區(qū)別，但DYRK1A的N端表現(xiàn)出顯著的不穩(wěn)定性，在細(xì)胞內(nèi)極易被降解。
　　4.DYRK1A的N端34-71氨基酸殘基序列中存在βTrCP的結(jié)合位點(diǎn):我們通過co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)βTrCP與DYRK1A蛋白的N端結(jié)合;我們進(jìn)一步構(gòu)建了DYRK1A蛋白的N端內(nèi)截短突變體，發(fā)現(xiàn)DYRK1A蛋白的N端34-71氨基酸殘基序列中存在βTrCP的結(jié)合位點(diǎn)，并且當(dāng)DYRK1A缺少N端34-71氨基酸殘基時，其半衰期明顯延長，泛素化水平也

9、明顯降低。
　　研究結(jié)論：
　　1.E3連接酶SCFβTrCP介導(dǎo)DYRK1A通過泛素-蛋白酶體途徑降解。
　　2.DYRK1A蛋白N端的49SDQQVSALS57序列是SCFβTrCP的結(jié)合位點(diǎn)。
　　3.SCFβTrCP介導(dǎo)DYRK1A蛋白降解維持細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。
　　第二部分 DYRK1A通過下調(diào)c-Myc調(diào)節(jié)AML細(xì)胞增殖和耐藥
　　研究目的：
　　研究DYRK1A在AML病人中的表

10、達(dá)情況，探索DYRK1A對AML細(xì)胞增殖和耐藥的作用，闡明DYRK1A對c-Myc蛋白的作用和分子機(jī)制，為AML靶向藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.檢測AML患者體內(nèi)DYRK1A的mRNA水平:收集初診（55例）和復(fù)發(fā)(16例）的AML患者及正常人的骨髓標(biāo)本，采用Ficoll-Hypaque方法分離單個核細(xì)胞，采用Trizol試劑分離RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用SYBR Green Real-time qPCR檢測

11、各樣本中DYRK1A的mRNA水平。
　　2.研究DYRK1A對AML細(xì)胞增殖的影響:用DYRK1A慢病毒顆粒感染AML細(xì)胞系，采用SYBR Green Real-time qRT-PCR方法確定DYRK1A成功過表達(dá);為了研究DYRK1A對AML細(xì)胞增殖的影響，我們采用MTT方法繪制細(xì)胞生長曲線，采用流式細(xì)胞術(shù)確定細(xì)胞周期的變化，同時我們還檢測了p21、cyclin D1和CDK2等細(xì)胞周期蛋白的水平;為了排除細(xì)胞凋亡對實(shí)驗(yàn)結(jié)果

12、的影響，我們采用annexin V-PE/7-AAD雙染色方法檢測了細(xì)胞凋亡水平。
　　3.研究DYRK1A對c-Myc的作用及分子機(jī)制:我們在AML細(xì)胞中過表達(dá)DYRK1A，分別采用western blot和SYBR Green Real-time qRT-PCR檢測了c-Myc的蛋白和mRNA的變化;為了研究DYRK1A能否促進(jìn)c-Myc蛋白降解，我們在Hek293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染DYRK1A，通過western blot檢測c-M

13、yc的半衰期和Ser62及Thr58的磷酸化水平;為了進(jìn)一步證明D YRK1A是否直接磷酸化c-Myc，我們采用co-IP方法驗(yàn)證DYRK1A和c-Myc的結(jié)合作用。
　　4.研究DYRK1A是否通過c-Myc影響AML細(xì)胞的增殖:為了證明DYRK1A是否通過磷酸化c-Myc調(diào)控AML細(xì)胞的增殖，首先我們采用干擾載體下調(diào)c-Myc的mRNA和蛋白后，檢測細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)，如cyclin D1、CDK2和p21的表達(dá)水平;我們進(jìn)一步

14、在DYRK1A過表達(dá)的細(xì)胞系中同時過表達(dá)c-Myc，觀察細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和p21的變化。
　　研究結(jié)果：
　　1.AML患者體內(nèi)DYRK1A的mRNA水平顯著偏低:我們通過real-time qRT-PCR發(fā)現(xiàn)AML患者體內(nèi)DYRK1A的mRNA水平明顯低于正常人群，而且與初診的AML患者相比，復(fù)發(fā)的AML患者體內(nèi)DYRK1A的mRNA水平顯著下降。
　　2.過表達(dá)DYRK1A明顯抑制AML細(xì)胞

15、的增殖:在細(xì)胞系HEL、HL-60和NB4中過表達(dá)DYRK1A后，其增殖速率明顯受到抑制;通過流式細(xì)胞術(shù)我們發(fā)現(xiàn)DYRK1A過表達(dá)可明顯降低處于S期而顯著升高處于G0/G1期的細(xì)胞比例;與之相對應(yīng)，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)DYRK1A的細(xì)胞中p21蛋白水平明顯升高，而cyclin D1和CDK2的蛋白水平明顯下降;通過流式細(xì)胞術(shù)我們發(fā)現(xiàn)DYRK1A過表達(dá)對細(xì)胞凋亡和死亡影響甚微，排除了細(xì)胞凋亡對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。
　　3.DYRK1A通過磷酸

16、化促進(jìn)c-Myc降解:我們發(fā)現(xiàn)DYRK1A過表達(dá)可顯著升高c-Myc的蛋白而非mRNA水平，且明顯降低c-Myc的降解速率;我們進(jìn)一步證明DYRK1A可有效升高與c-Myc降解密切相關(guān)的Ser62及Thr58殘基的磷酸化水平;通過co-IP實(shí)驗(yàn)，我們證明DYRK1A可與c-Myc相結(jié)合。
　　4.DYRK1A通過降低c-Myc影響AML細(xì)胞的增殖:在HEL細(xì)胞系中敲除c-Myc后，p21的mRNA水平顯著增加105.36±42.9