靶向VEGF的miR-126在結(jié)直腸癌侵襲和血管生成過(guò)程中的調(diào)控作用.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、研究背景和目的:
   腫瘤轉(zhuǎn)移播散一直是腫瘤治療研究中的一大難題。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離,侵入間質(zhì),內(nèi)滲進(jìn)入血管,隨血流到達(dá)遠(yuǎn)處器官組織定植,繼續(xù)增殖成瘤,多器官受累加速患者死亡。單就結(jié)直腸癌而言,50%的癌灶會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌導(dǎo)致的患者死亡,90%是由于腫瘤的轉(zhuǎn)移播散引起。腫瘤血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵性事件,抑制腫瘤血管生成能顯著地抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移??鼓[瘤血管生成是不同于常規(guī)抗腫瘤治療的新策略。
  

2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體調(diào)控途徑則是腫瘤血管形成的核心因素。在結(jié)直腸癌的發(fā)展過(guò)程中,VEGF的作用尤為突出。VEGF在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁正常粘膜,且表達(dá)水平與腫瘤大小顯著相關(guān)。高表達(dá)的VEGF不但促進(jìn)腫瘤血管新生,而且與結(jié)直腸癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Dukes分期呈正相關(guān)。VEGF受體家族廣泛表達(dá)于瘤細(xì)胞及間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)一步說(shuō)明VEGF及其受體信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。近年,針對(duì)VE

3、GF及其受體的靶向治療已經(jīng)成為抗腫瘤治療的重要策略。如人源化VEGF單抗bevacizumab,其聯(lián)合化療藥物常被用作治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的一線方案。另外還有可抑制VEGFR酪氨酸激酶的藥物sunitinib和sorafenib等。microRNA在人體組織中廣泛表達(dá),對(duì)30%的編碼基因行使調(diào)節(jié)功能,對(duì)增殖、分化、死亡等基本細(xì)胞過(guò)程具有重要的調(diào)控作用。近期,在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)有不同microRNA的異常表達(dá),說(shuō)明特異性的microRNA與腫

4、瘤發(fā)生有密切聯(lián)系。它們可能扮演致癌基因或者抑癌基因的角色,這取決于它們作用的靶基因。一些具有促癌或者抑癌作用的microRNA連同它們的靶基因已經(jīng)相繼被鑒定出來(lái)。例如,在結(jié)直腸癌中,miR-143的表達(dá)降低是KRAS持續(xù)激活并促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化的重要原因;miR-135則可以抑制APC的表達(dá),異常激活WNT通路。這可能是除APC基因突變以外存在的另一種APC失調(diào)的情況。
   作為明確的促癌因子,VEGF是microRNA的調(diào)控靶點(diǎn)。

5、miR-126可以通過(guò)抑制SPRED1、PIK3R2,解除二者對(duì)VEGF信號(hào)途徑的抑制,促進(jìn)胚胎血管形成并維持管壁的完整性。VEGF可以增加miR-296的表達(dá),靶向抑制HGS,解除其對(duì)PDGFR和VEGFR2的抑制,提高VEGF的作用效率,促進(jìn)腫瘤血管生成,形成一個(gè)正反饋路徑。這些研究均提示,microRNA對(duì)以VEGF及其受體為中心的腫瘤血管生成過(guò)程具有重要的調(diào)控作用,調(diào)節(jié)某些特異性microRNA的表達(dá)可能成為抗VEGF治療的新手

6、段。
   我們?cè)谇捌诘纳镄畔W(xué)分析中發(fā)現(xiàn),VEGF是miR-126的預(yù)測(cè)靶基因。本研究希望通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)鑒定直腸癌中miR-126——VEGF這一靶向調(diào)控關(guān)系的存在,并進(jìn)一步探討miR-126表達(dá)缺失的原因,及其對(duì)VEGF介導(dǎo)的結(jié)直腸癌腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移過(guò)程的調(diào)控機(jī)制。
   研究方法和結(jié)果:
   1.miR-126在結(jié)直腸癌中的表達(dá)異常降低
   采用Taqman探針熒光定量PCR法檢測(cè)了12對(duì)結(jié)直

7、腸癌組織以及6種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中成熟miR-126的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,腫瘤組織中的miR-126表達(dá)水平與其相應(yīng)的癌旁正常粘膜相比,均顯著下降。其在6種細(xì)胞系中的表達(dá)水平也顯著低于正常對(duì)照(P<0.05)。
   2.恢復(fù)結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-126的表達(dá)水平能夠抑制VEGF的表達(dá)
   采用lipofectmin2000轉(zhuǎn)染miR-126的precusors進(jìn)入LoVo和SW620細(xì)胞株,以恢復(fù)miR-126的表達(dá)。

8、Western blot結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照相比,腫瘤細(xì)胞中miR-126表達(dá)水平恢復(fù)后,VEGF的表達(dá)受到了顯著抑制。但RT-PCR的結(jié)果中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)VEGF的mRNA表達(dá)水平變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示這種抑制作用可能是在蛋白翻譯水平產(chǎn)生的。
   3.miR-126通過(guò)與VEGF mRNA3'UTR結(jié)合而直接調(diào)控VEGF表達(dá)
   生物信息學(xué)預(yù)測(cè)在VEGF mRNA3'UTR中含有一個(gè)可與miR-126互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)。我

9、們分別構(gòu)建了含有野生型和突變型結(jié)合位點(diǎn)序列的熒光素酶報(bào)告基因(VEGF3'UTR/ mut VEGF3'UTR),將它們和miR-126的precursors或者scramble共轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞中,檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。共轉(zhuǎn)染miR-126 precursors/VEGF3'UTR的HEK293細(xì)胞,其熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-126 scramble/VEGF3'UTR的細(xì)胞,而共轉(zhuǎn)染miR-126 precurs

10、ors/mutVEGF3'UTR則可以抵消共轉(zhuǎn)染miR-126 precursors/VEGF3'UTR引起的熒光素酶活性降低。此結(jié)果說(shuō)明,miR-126確實(shí)是通過(guò)與VEGF mRNA的3'UTR直接結(jié)合,從而遏制VEGF的蛋白翻譯過(guò)程。
   4.恢復(fù)miR-126表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力,但不影響其增殖
   利用alarmar blue法檢測(cè)LoVo和SW620細(xì)胞恢復(fù)miR-126表達(dá)后細(xì)胞的增殖能

11、力變化。實(shí)驗(yàn)分組為:未處理組(blank)、陰性對(duì)照組(scramble)和處理組(pre-miR-126),每組分別檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理后24h、48h和72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染處理后的72h內(nèi),不同處理組的LoVo或SW620細(xì)胞之間,其增殖能力均未出現(xiàn)差異變化(P>0.05)。提示miR-126并不參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖調(diào)控。運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn),檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞在miR-126表達(dá)水平恢復(fù)后,其細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力,

12、即遷移能力和侵襲能力的改變。處理分組同增值實(shí)驗(yàn),細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理24h后,將細(xì)胞消化重懸加入Transwell裝置上室(侵襲試驗(yàn)上室預(yù)鋪基質(zhì)膠Matrigel),下室為含20%FBS的新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后,計(jì)數(shù)上室濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示,恢復(fù)miR-126后的結(jié)直腸癌細(xì)胞,其遷移和侵襲能力相比未處理和陰性對(duì)照處理組均顯著減弱(P<0.05)。
   5.恢復(fù)miR-126的表達(dá)能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞通過(guò)分泌VEGF誘導(dǎo)的腫瘤

13、血管形成
   轉(zhuǎn)染precusors恢復(fù)LoVo細(xì)胞中miR-126的表達(dá)水平,在轉(zhuǎn)染后48h取細(xì)胞培養(yǎng)基檢測(cè)其中VEGF的濃度。結(jié)果在10nM、30nM和30nM的轉(zhuǎn)染濃度下,LoVo細(xì)胞培養(yǎng)基中的VEGF濃度3.61±0.08 ng/ml、3.05±0.08 ng/ml和2.68±0.11 ng/nl均顯著低于未處理組(blank)的4.12±0.18 ng/ml和陰性對(duì)照組(scramble)的3.99±0.10 ng/

14、ml(P<0.05)。內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中,在transwell體系中將人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC)和經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染處理的LoVo細(xì)胞共培養(yǎng)24h后,計(jì)數(shù)上室濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示,與恢復(fù)了miR-126表達(dá)的LoVo細(xì)胞(pre-miR-126)共培養(yǎng)的HMVEC細(xì)胞,其遷移能力顯著低于與未處理組(blank)和陰性對(duì)照組(scramble) LoVo細(xì)胞共培養(yǎng)的HMVEC細(xì)胞(P<0.05)。體外的小管形成實(shí)驗(yàn)中,在LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)染

15、后的48h,收集未處理組(blank)、陰性處理組(scramble)和處理組(pre-miR-126)的細(xì)胞培養(yǎng)基,用以重懸HMVEC細(xì)胞,以0.5×104/well數(shù)量將HMVEC種入預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠的96孔板中。37℃孵育細(xì)胞12h,顯微鏡下計(jì)數(shù)HMVEC形成的完整封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,處理組培養(yǎng)基刺激HMVEC細(xì)胞形成小管的能力顯著地弱于未處理組和陰性處理組。進(jìn)一步利用雞胚絨毛膜尿囊實(shí)驗(yàn)?zāi)P驮u(píng)估m(xù)iR-126表達(dá)水

16、平對(duì)于體內(nèi)腫瘤血管生成能力的影響。以無(wú)菌明膠海面為載體,分別攜帶各組上述收集到的培養(yǎng)基,將載體置于雞胚絨毛尿囊膜血管稀疏部位,計(jì)算以載體為中心向四周放射狀生成的毛細(xì)血管數(shù),以此評(píng)價(jià)血管新生能力。結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果近似,處理組培養(yǎng)基(pre-miR-126)刺激雞胚血管新生的能力顯著弱于未處理組(blank)和陰性對(duì)照組(scramble)(P<0.05)。
   6.啟動(dòng)子甲基化是結(jié)直腸癌中miR-126的表達(dá)缺失的重要原因

17、r>   采用MSP方法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中miR-126啟動(dòng)子區(qū)的甲基化修飾情況。被檢測(cè)的62例結(jié)直腸癌組織中,有50例在miR-126啟動(dòng)子區(qū)有甲基化修飾存在。而對(duì)6種結(jié)直腸癌細(xì)胞株的MSP檢測(cè)結(jié)果則顯示,6種細(xì)胞株均受不同程度的甲基化修飾。進(jìn)一步的BSP測(cè)序結(jié)果與MSP結(jié)果符合,各細(xì)胞株miR-126啟動(dòng)子區(qū)CpG島內(nèi)的CG二核苷酸均有較高頻率地甲基化修飾。使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-CdR處理六種細(xì)胞株,使其啟動(dòng)子區(qū)去甲基化

18、后收集細(xì)胞,利用real time-PCR檢測(cè)miR-126的表達(dá)情況,并用western blot檢測(cè)VEGF的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)去甲基化處理后,各細(xì)胞株中miR-126的表達(dá)水平均有顯著提高,而隨著miR-126表達(dá)的上調(diào),VEGF的表達(dá)也受到相應(yīng)抑制。提示啟動(dòng)子區(qū)的甲基化是使得結(jié)直腸癌中miR-126表達(dá)異常降低甚至缺失的重要原因,并且是結(jié)直腸癌中VEGF表達(dá)異常增高的原因之一。
   結(jié)論:
   本研究證實(shí)

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