“黃連-干姜”藥對(duì)預(yù)防炎癥性腸病及其相關(guān)結(jié)腸癌作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　炎癥性腸病是一種腸道的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病，主要包含克羅恩病(Crohn'sDisease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)，主要癥狀為腹痛、腹瀉、黏液便及膿血便，大約一半的嚴(yán)重病例需要手術(shù)治，并且常常伴隨嚴(yán)重的并發(fā)癥，持續(xù)的慢性炎癥還可以增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，并且，有研究表明，結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與腸道炎癥的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間成正相關(guān)。
　　黃連在治療胃腸

2、道炎癥方面有著突出的優(yōu)勢(shì)，無論是結(jié)腸炎還是結(jié)腸癌均有一定的療效，但是黃連為苦寒之品，長(zhǎng)期服用會(huì)帶來一些不良反應(yīng)。“黃連-干姜”藥對(duì)在中醫(yī)臨床上體現(xiàn)了寒溫并用的思想，是導(dǎo)師在臨床常用的一種配伍，能夠緩解長(zhǎng)期應(yīng)用苦寒藥治療慢性疾病帶來的一系列不良反應(yīng)。本研究采用DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型、巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、HCT116作為研究對(duì)象，探討“黃連-干姜”藥對(duì)預(yù)防結(jié)腸炎的作用及機(jī)制，以及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的促凋亡作用

3、及機(jī)制。
　　方法:
　　1.“黃連-干姜”藥對(duì)主要化學(xué)成分的研究
　　按1∶1比例稱取干姜、黃連共400g，加8倍量水，冷浸1h，微沸回流1h，傾出藥液，再加7倍量水，微沸回流30min，傾出藥液，合并兩次的藥液，濾紙過濾，減壓濃縮，冷凍干燥，稱量?jī)龈煞壑亓繛?1.8g，備用。稱取1g上述全方藥凍干粉，加ddH2O20.96 Ml，離心(14000 rpmx30 min)，取上清液，即得含有0.6g/ml原藥的溶液。

4、根據(jù)文獻(xiàn)，組建黃連和干姜兩味藥的化學(xué)成分信息庫(kù)。建立“黃連-干姜”液質(zhì)聯(lián)用(UPLC/Q-TOF-MSS)的分析方法，并運(yùn)用該方法對(duì)“黃連-干姜”化學(xué)成分進(jìn)行分析。根據(jù)色譜保留時(shí)間、精確分子量、分子碎片峰、對(duì)照品信息和自建的兩味組方藥材的化學(xué)成分信息庫(kù)，對(duì)主要色譜峰的來源進(jìn)行了歸屬和鑒定，并且定量測(cè)定水提物中berberine和6-gingerol的含量。
　　2.“黃連-干姜”藥對(duì)預(yù)防DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎作用及機(jī)制研究

5、　　將45只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、中藥低劑量[1.2g/(kg·d)]組、中藥中劑量[2.4g/(kg·d)]組、中藥高劑量[4.8g/(kg· d)]組，中藥組預(yù)防性灌胃給藥7d后（空白組和模型組灌胃等量生理鹽水），在繼續(xù)給予相應(yīng)干預(yù)的同時(shí)，模型組、中藥組分別給予3％DSS(Dextran Sulfate Dodium)水溶液自由飲用，每2d更換一次，連續(xù)飲用7d，空白組小鼠給予自來水自由飲用。記錄每日疾病活動(dòng)

6、指數(shù)(Disease Activity Index DAI)評(píng)分，取材后測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度，HE染色觀察結(jié)腸病理變化并記錄病理組織學(xué)評(píng)分，計(jì)算臟器指數(shù)，ELISA法檢測(cè)小鼠血漿中IL-6和TNF-α水平，Western blot法檢測(cè)結(jié)腸上皮細(xì)胞中NF-κB、JAK2和STAT3蛋白磷酸化水平，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)腸組織中NF-κB和p-STAT3表達(dá)水平。
　　3.“黃連-干姜”藥對(duì)預(yù)防LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)及其機(jī)制

7、研究
　　MTT法檢測(cè)0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml“黃連-干姜”水提物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞的殺傷作用。預(yù)防性給予“黃連-干姜”水提物(0、0.5、1、2mg/ml)1h后，給予LPS刺激8h，ELSIA法檢測(cè)培養(yǎng)基IL-6和TNF-α的含量，Westernblot法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中STAT3磷酸化水平，免疫熒光法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中p-STAT3和NF-κ B表達(dá)水平。

8、>　　4.“黃連-干姜”對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29和HCT116的作用及機(jī)制研究
　　MTT法檢測(cè)0、1、2、4、6、8、15mg/ml“黃連-干姜”水提物對(duì)HT-29和HCT116細(xì)胞的殺傷作用，給予“黃連-干姜”水提物0、1、1.5mg/ml分別干預(yù)HT-29和HCT116細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞儀PI/AnnexinⅤ-FITC雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blot法檢測(cè)Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)水平和S

9、TAT3蛋白磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　1.“黃連-干姜”藥對(duì)主要化學(xué)成分的研究
　　建立了“黃連-干姜”藥對(duì)液質(zhì)聯(lián)用的分析方法，并成功運(yùn)用該方法對(duì)“黃連-干姜”藥對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行了分析。根據(jù)色譜保留時(shí)間、精確分子量、分子碎片峰、對(duì)照品信息和自建的兩味組方藥材的化學(xué)成分信息庫(kù)，對(duì)主要色譜峰的來源進(jìn)行了歸屬和鑒定，歸屬并鑒定了28個(gè)主要色譜峰，同時(shí)定量檢測(cè)了berberine的濃度為54.43mM，6-gingerol藥

10、物濃度為2.2mM。
　　2.“黃連-干姜”藥對(duì)預(yù)防DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎作用及機(jī)制研究
　　模型組動(dòng)物在飲用3％DSS后從第2天開始，DAI較空白組均升高;與模型組比較，中藥低劑量組在造模后DAI均降低，但僅在飲用3％DSS第2、4、6天差異才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中藥中劑量組DAI于飲用3％DSS后除了第4天，均低于模型組，并持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束;中藥高劑量組DAI于飲用3％DSS第2天即低于模型組，并持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
　　模型

11、組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度較空白組明顯縮短(P＜0.01);與模型組相比，中藥低、中劑量組結(jié)腸長(zhǎng)度增長(zhǎng)(P＜0.05)，中藥高劑量組結(jié)腸長(zhǎng)度顯著增長(zhǎng)(P＜0.01)。模型組結(jié)腸組織病理評(píng)分較空白組顯著升高（P＜0.01）;與模型組相比，中藥低劑量組結(jié)腸組織病理評(píng)分無明顯變化，中藥中劑量組結(jié)腸組織病理評(píng)分降低（P＜0.05），中藥高劑量組結(jié)腸組織病理評(píng)分顯著降低(P＜0.01)。
　　模型組小鼠血漿中IL-6含量較空白組顯著上升（P＜0.01）

12、;與模型組相比，中藥各個(gè)劑量組小鼠血漿中IL-6含量較模型組均顯著降低（P＜0.01）。與空白組相比，模型組血漿中TNF-α含量顯著上升（P＜0.01），與模型組相比，中藥各個(gè)劑量組小鼠血漿中TNF-α含量較模型組均顯著降低（P＜0.01）。
　　結(jié)腸組織中NF-κB、JAK2和STAT3蛋白活化水平模型組均顯著高于空白組(P＜0.01);中藥低、高劑量組小鼠腸上皮細(xì)胞中NF-κB蛋白磷酸化水平均比模型組明顯降低(P＜0.01);

13、和模型組相比，中藥低、高劑量組腸上皮細(xì)胞中JAK2蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），中藥各個(gè)劑量組腸上皮細(xì)胞中STAT3蛋白磷酸化水平顯著降低(P＜0.01)。
　　3.“黃連-干姜”藥對(duì)預(yù)防LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)及其機(jī)制研究
　　MTT結(jié)果顯示“黃連-干姜”水提物作用36h對(duì)RAW264.7細(xì)胞半數(shù)致死濃度為3.79mg/ml，ELSIA結(jié)果發(fā)現(xiàn)“黃連-干姜”水提物可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264

14、.7細(xì)胞炎癥因子IL-6和TNF-α分泌水平，Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示“黃連-干姜”可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NF-κB和STAT3蛋白的激活。
　　4.“黃連-干姜”對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29和HCT116的作用及機(jī)制研究
　　MTT結(jié)果顯示“黃連-干姜”水提物可以顯著抑制HT29和HCT116細(xì)胞的活力，作用48h的IC50分別為5.648mg/ml和2.43mg/ml。流式細(xì)胞儀檢測(cè)

15、發(fā)現(xiàn)“黃連-干姜”水提物可以顯著促進(jìn)HT29和HCT116的凋亡比率，Western blot結(jié)果顯示“黃連-干姜”可以顯著促進(jìn)HT29和HCT116細(xì)胞中Cleaved Caspase3的表達(dá)，抑制STAT3蛋白的磷酸化。
　　結(jié)論:
　　1.“黃連-干姜”藥對(duì)水提物可以顯著抑制DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型癥狀體征，改善局部病理?yè)p傷，抑制DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型血漿炎癥因子的含量，其作用機(jī)制可能是通過抑制DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)

16、腸炎模型結(jié)腸局部NF-κB信號(hào)通路及JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活而起作用。
　　2.“黃連-干姜”可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌，可能是通過抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NF-κB和JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活而起到了作用。
　　3.“黃連-干姜”藥對(duì)可以顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29和HCT116的增殖，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29和HCT116的凋亡，可能是通