防御素在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的 炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病機(jī)制涉及遺傳、環(huán)境、免疫反應(yīng)等，但真正的致病元兇尚不清楚。腸粘膜可直接產(chǎn)生免疫效應(yīng)分子對(duì)抗腸腔內(nèi)微生物，或通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)啟動(dòng)粘膜獲得性免疫反應(yīng)，介導(dǎo)直接的粘膜保護(hù)反應(yīng)。防御素是一類非常重要的免疫效應(yīng)分子。β防御素-2誘導(dǎo)性表達(dá)于上皮細(xì)胞，發(fā)揮抗微生物活性。本課題利用惡唑酮小鼠結(jié)腸炎模型研究結(jié)腸粘膜組織中β防御素-2與促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)以及相互關(guān)系，探討β防御素-2表達(dá)的調(diào)控機(jī)

2、制，旨在探索結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)擴(kuò)大的原因。 材料與方法 1．建立小鼠惡唑酮結(jié)腸炎模型，進(jìn)行大體和組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。2．免疫組化方法測(cè)定小鼠結(jié)腸粘膜β防御素-2、TNF-α、IL-1 β、NF-κ Bp65、ERK-1、pERK蛋白表達(dá)。3．熒光定量RT-PCR測(cè)定小鼠結(jié)腸粘膜β防御素-2、TNF-α、IL-l β和NF-κ Bp65mRNA的表達(dá)。4．Western B1otting蛋白印跡測(cè)定小鼠結(jié)腸粘膜β防御素-2蛋白的表

3、達(dá)。5．ELISA測(cè)定兩組結(jié)腸粘膜組織上清液中TNF-α和IL-1 β的表達(dá)。6．細(xì)胞培養(yǎng)：Caco 2細(xì)胞株加LPS刺激，再與HBD2抗體共同孵育。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同時(shí)段TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)變化情況。 結(jié)果 1．小鼠惡唑酮結(jié)腸炎造模成功，小鼠結(jié)腸粘膜有肉眼和組織學(xué)炎癥。2．免疫組化檢測(cè)到β防御素-2在β組結(jié)腸粘膜表達(dá)顯著高于A組(p

4、達(dá)顯著高于A組(p

5、mRNA表達(dá)水平B組顯著高于A組，兩組比較有顯著性差異(p

6、組，兩組比較有顯著性差異(p<0.05)。 結(jié)論 1．惡唑酮結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸粘膜β防御素-2的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組。促炎因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，且與β防御素-2的表達(dá)呈平行關(guān)系。說(shuō)明β防御素-2的表達(dá)與促炎因子的表達(dá)密切相關(guān)，兩者相加可能是結(jié)腸炎癥反應(yīng)放大、持續(xù)遷延的原因之一。2．惡唑酮結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸粘膜NF-kBp65、ERK-1、pERK表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，且與β防御素-2的表達(dá)呈正相關(guān)

7、，推測(cè)β防御素-2的誘導(dǎo)表達(dá)涉及NF-kB和MAPK等多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路。3．阻斷β防御素-2后，下調(diào)Caco2細(xì)胞株對(duì)TNF-α和IL-1βmRNA水平的表達(dá)，及其具有時(shí)效關(guān)系，提示HBD2可能促進(jìn)TNF-α和IL-1β的分泌，在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中有重要作用。 目的 采用Oxazolone小鼠結(jié)腸炎模型進(jìn)行研究，給予小鼠益生菌混合制劑VSL[＃]3干預(yù)，觀察對(duì)小鼠結(jié)腸炎的預(yù)防治療作用及其對(duì)β防御素-2、TNF-α、IL

8、-1 β、NF-κ Bp65、ERK-1和pERK表達(dá)的影響，從分子水平探討腸道益生菌減輕炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用益生菌治療IBD奠定理論基礎(chǔ)。 材料與方法 1．建立小鼠惡唑酮結(jié)腸炎模型并分組：6-8周齡健康雌性Balb/c小鼠分兩組，即治療組和預(yù)防組。每組又分為三個(gè)亞組，即VSL[＃]3預(yù)防組、SASP預(yù)防組、預(yù)防對(duì)照組；VSL[＃]3治療組、SASP治療組、治療對(duì)照組。然后取結(jié)腸組織進(jìn)行大體和組織病理學(xué)

9、評(píng)價(jià)VSL[＃]3的療效。2．免疫組化方法檢測(cè)各組結(jié)腸粘膜組織中β防御素-2、TNF-α、IL-1 β的表達(dá)情況，以及NF-k Bp65、ERK-1和pERK的表達(dá)情況。3．RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組結(jié)腸組織中β防御素-2、TNF-α、IL-1 β、NF-k Bp65mRNA 的表達(dá)情況。4．Western blot方法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸粘膜β防御素-2的蛋白表達(dá)情況。5．ELISA方法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸粘膜組織上清液中TNF-α、IL-1β

10、蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 1．VSL[＃]預(yù)防組和治療組小鼠結(jié)腸粘膜病變的大體和組織病理學(xué)評(píng)分顯著低于預(yù)防對(duì)照組和治療對(duì)照組(p<0.05)，與SASP預(yù)防組和治療組比較無(wú)顯著性差異(p>0.05)。2．免疫組化方法檢測(cè)VSL[＃]3預(yù)防組和VSL[＃]3治療組結(jié)腸粘膜組織中β防御素-2、TNF-α、IL-1β、的表達(dá)顯著低于預(yù)防對(duì)照組和治療對(duì)照組(p<0.05)，與SASP預(yù)防組和治療組比較沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)

11、。VSL[＃]3預(yù)防組和治療組結(jié)腸粘膜組織中NF-K Bp65、ERK-1和pERK蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較顯著下調(diào)(p>0.05)。3．RT-PCR檢測(cè)VSL[＃]預(yù)防組和VSL[＃]治療組結(jié)腸粘膜組織中β防御素-2、TNF-α、IL-1β和NF-kBp65mRNA表達(dá)顯著低于預(yù)防對(duì)照組和治療對(duì)照組(p<0.05)，與SASP預(yù)防組和SASP治療組比較沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)。4．Western blot方法檢測(cè)VSL[＃]3預(yù)防

12、組和治療組結(jié)腸粘膜β防御素-2的蛋白表達(dá)顯著低于預(yù)防對(duì)照組和治療對(duì)照組(p<0.05)。5．ELISA方法檢測(cè)VSL[＃]3預(yù)防組和治療組結(jié)腸粘膜組織上清液中TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)顯著低于預(yù)防對(duì)照組和治療對(duì)照組(p<0.05)。 結(jié)論 1．VSL[＃]3對(duì)惡唑酮誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎有預(yù)防作用和治療作用。2．VSL[＃]3預(yù)防治療惡唑酮誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的機(jī)制可能與下調(diào)促炎因子和β防御素-2的表達(dá)有關(guān)。3．VSL[＃]

13、3下調(diào)促炎因子和β防御素-2的表達(dá)可能涉及NF-κB和MAPKs等多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路。 目的 本研究檢測(cè)人類潰瘍性結(jié)腸炎(UC)結(jié)腸粘膜中HBD2和TNF-α、IL-1 β在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，探討防御素和細(xì)胞因子表達(dá)之間的關(guān)系，以及在UC發(fā)生發(fā)展中的作用。同時(shí)檢測(cè)了UC結(jié)腸粘膜中NF-κ Bp65的表達(dá)和MAPKs通路中ERK-1和pERK在結(jié)腸粘膜組織中的表達(dá)，旨在探討UC患者中HBD2激活的信號(hào)傳導(dǎo)通路，

14、以及在UC發(fā)病中的作用。 材料與方法 1．選擇2004.12～2005.12四川大學(xué)華西醫(yī)院消化科確診的UC患者，計(jì)算疾病活動(dòng)度(LJCAI)，對(duì)UC進(jìn)行病理學(xué)分級(jí)。2．免疫組化方法檢測(cè)UC和正常對(duì)照組結(jié)腸粘膜中HBD2和TNF-α、IL-l β的表達(dá)，以及NF-κ Bp65、ERK-1和pERK的表達(dá)。3．實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法測(cè)定UC患者和正常對(duì)照組中HBD2、TNF-α、IL-l β、NF-κ Bp65 m

15、RNA在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。4．Western blot方法檢測(cè)UC患者和正常對(duì)照組結(jié)腸粘膜HBD2蛋白的表達(dá)。5．ELISA方法檢測(cè)UC患者和正常對(duì)照組結(jié)腸粘膜TNF-α、IL-1β蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 1．35例UC患者中輕度10例，中度13例，重度12例。病理分級(jí)Ⅰ級(jí)11例，Ⅱ級(jí)13例，Ⅲ級(jí)11例。IJCA工評(píng)分與病理分級(jí)之間呈正相關(guān)(p<0.05)。2．免疫組化方法發(fā)現(xiàn)HBD2、TNF-α、IL-1β在UC結(jié)腸粘膜的

16、表達(dá)顯著高于對(duì)照組，陽(yáng)性率隨病理學(xué)分級(jí)增高而逐漸增高(p<0.05)，炎癥粘膜區(qū)表達(dá)顯著高于非炎癥粘膜區(qū)(p<0.05)；NF-κ Bp65、ERK-1和pERK表達(dá)在UC患者顯著高于正常對(duì)照組(p<0.05)，炎癥粘膜區(qū)顯著高于非炎癥粘膜區(qū)(p<0.05)。HBD2與TNF-α、IL-1β、NF-κ Bp65、ERK-l和pERK的表達(dá)呈正相關(guān)。3．實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HBD2、TNF-α、IL-1 β、NF-κ Bp65

17、mRNA在UC結(jié)腸粘膜的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，隨病理學(xué)分級(jí)增高逐漸增強(qiáng)(p<0.05)，炎癥粘膜區(qū)表達(dá)顯著高于非炎癥粘膜區(qū)，HBD2與TNF-α、IL-l β、NF-κ Bp65的表達(dá)間呈正相關(guān)。4．western blot證實(shí)UC結(jié)腸上皮HBD2的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(p<0.05)，且炎癥粘膜區(qū)顯著高于非炎癥粘膜區(qū)(p<0.05)。5．ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示UC結(jié)腸上皮TNF-α、IL-1 β蛋白表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(p<0.05

18、)，且炎癥粘膜區(qū)顯著高于非炎癥粘膜區(qū)(p<0.05)。 結(jié)論 1．UC結(jié)腸粘膜HBD2表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組、炎癥粘膜部位顯著高于非炎癥粘膜部位，且與促炎因子TNF α和IL-β的表達(dá)呈正相關(guān)，提示HBD2和促炎因子互為因果、互相誘生，使炎癥反應(yīng)不斷放大、使UC炎癥損傷不斷加重。2．UC結(jié)腸粘膜NF-κ Bp65、ERK-1和pERK的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，且與HBD2的表達(dá)呈正相關(guān)，提示HBD2在UC結(jié)腸粘膜中的上