Syndecan-1與炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制關(guān)系的初步探討.pdf

1、研究背景與目的： 炎癥性腸病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）是一種病因尚不明確的慢性非特異性腸道炎性病變，包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）和克羅恩?。–rohn's Disease，CD），是胃腸道最為嚴(yán)重的疾病之一。該病常突發(fā)起病，多數(shù)病程緩慢，有反復(fù)發(fā)作的傾向，少數(shù)病例呈急性暴發(fā)，病情兇險(xiǎn)，病程較長(zhǎng)者亦被認(rèn)為結(jié)腸癌的癌前病變，世界衛(wèi)生組織將其列為難治性疾病之一。該

2、病在我國(guó)發(fā)病率比較低，但近年來(lái)有大幅增加的趨勢(shì)。目前認(rèn)為IBD的發(fā)病機(jī)制為：環(huán)境因素作用于遺傳易感者，在腸道菌叢的參與下，啟動(dòng)了腸道免疫及非免疫系統(tǒng)，最終導(dǎo)致免疫反應(yīng)和炎癥過(guò)程。但是始終未找到一種特定微生物和IBD恒定相關(guān)。 Syndecans是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，包含有硫酸乙酰肝素（HS）及硫酸軟骨素鏈修飾的Ⅰ型跨膜核心蛋白。硫酸乙酰肝素鏈能與許多對(duì)血管修復(fù)、血管發(fā)生及免疫細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間黏附起調(diào)節(jié)

3、作用的配體如許多生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞外基質(zhì)等相互作用。Syndecans主要包括四個(gè)成員，其中Syndecan-1（CD138）是上皮細(xì)胞包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的主要Syndecans成員。Syndecan-1攜帶的HS側(cè)鏈可結(jié)合一系列配體如細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞外基質(zhì)成份、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子等，以共受體方式調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用，參與細(xì)胞粘附、組織分化、血管形成及宿主防御等諸多生理病理過(guò)程的調(diào)節(jié)。 關(guān)于

4、Syndecan-1和腫瘤關(guān)系研究比較多，但是在炎癥方面卻是近幾年才開(kāi)始受到重視，國(guó)內(nèi)罕見(jiàn)報(bào)道。Syndecan-1胞外段可在脫落酶（sheddase）作用下從細(xì)胞表面水解脫落形成可溶性效應(yīng)分子并被吸收入血。Syndecan-1的胞外段HS鏈，是其主要功能部位，能與炎癥過(guò)程中的眾多的粘附分子、細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞因子、趨化因子等結(jié)合，在炎細(xì)胞的滾動(dòng)、貼壁、黏附、游出等步驟中發(fā)揮作用，因此可認(rèn)為，Syndecan-1與炎癥過(guò)程關(guān)系密切。在

5、Syndecan-1基因敲除（Sdc1-/-）小鼠中，生長(zhǎng)及發(fā)育均無(wú)異常。但是在綠膿桿菌的攻擊下，Sdc1-/-小鼠明顯耐受感染，表現(xiàn)出顯著下降的細(xì)菌定植力及明顯減輕的肺部炎癥和死亡率，說(shuō)明Syndecan-1促進(jìn)了感染性炎癥的發(fā)生。Syndecan-1還參與細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的粘附。介導(dǎo)細(xì)胞粘附到胞外基質(zhì)蛋白的主要受體為整臺(tái)素家族受體，但胞外基質(zhì)蛋白還具有結(jié)合糖胺聚糖的能力，尤其是硫酸乙酰肝素。細(xì)胞能利用整合素和Syndecan-1雙受

6、體來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的粘附。 而在炎癥的研究中，國(guó)外就肺炎與Syndecan-1的關(guān)系研究較多。在肺炎中，已證實(shí)MMP-7可導(dǎo)致Syndecan-1的脫落，形成的可溶性Syndecan-1與中性粒細(xì)胞趨化因子KC結(jié)合，動(dòng)員KC形成趨化梯度，吸引中性粒細(xì)胞，促進(jìn)肺炎的發(fā)生。但是關(guān)于Syndecan-1和腸炎之間的關(guān)系罕有報(bào)道。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，Syndecan-1在IBD模型小鼠腸上皮細(xì)胞表面的表達(dá)明顯減低，而血清中游離Sy

7、ndecan-1明顯增加，提示IBD與Syndecan-1脫落增加相關(guān)。有研究提示Syndecan-1表達(dá)缺失或破壞時(shí)可造成腸上皮屏障功能受損，導(dǎo)致蛋白丟失，分泌性腹瀉及營(yíng)養(yǎng)障礙等，而在IBD患者的再生粘膜中也存在Syndecan-1的表達(dá)缺失，從而影響?zhàn)つさ挠?。另外，Syndecan-1似乎也和各種細(xì)胞因子有相互作用。Day RM等證實(shí)促炎因子TNF-α，IL-1β對(duì)腸上皮細(xì)胞中Syndecan-1的表達(dá)起下調(diào)作用，可能機(jī)制為通過(guò)使

8、Syndecan-1的外功能區(qū)的脫落增加而引起腸道的炎癥反應(yīng)。 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要成分，也稱為內(nèi)毒素，在感染和炎癥中起著至關(guān)重要的作用。鑒于Syndecan-1與炎癥及感染關(guān)系密切，而腸道非特異性炎癥亦和感染有重要關(guān)系。基于以上背景，我們推測(cè)，腸道細(xì)菌可能通過(guò)影響Syndecan-1的表達(dá)來(lái)參與腸道非特異性炎癥的過(guò)程。因此我們通過(guò)與細(xì)菌感染密切相關(guān)的促炎因素TNF-α和L

9、PS刺激腸上皮細(xì)胞，觀察不同劑量刺激物對(duì)Syndecan-1表達(dá)的影響，為Syndecan-1在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供重要線索，研究?jī)?nèi)容包括： 1、Syndecan-1在不同疾病患者腸粘膜組織及不同腸上皮細(xì)胞系中的表達(dá); 2、不同劑量TNF-α刺激下Syndecan-1在腸上皮細(xì)胞的表達(dá)變化; 3、不同劑量LPS作用下腸上皮細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清中Syndecan-1的變化; 4、不同劑量LPS刺激下腸

10、上皮細(xì)胞粘附力的改變; 方法: 1、免疫組化法檢測(cè)IBD、結(jié)腸腺瘤及結(jié)腸腺癌患者腸粘膜組織中Syndecan-1的表達(dá)。 2、流式細(xì)胞儀分析不同腸上皮細(xì)胞株，篩選出Syndecan-1表達(dá)量高的SW480細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 3、免疫熒光染色法檢測(cè)不同劑量TNF-α刺激SW480細(xì)胞后，Syndecan-1表達(dá)變化。 4、免疫熒光染色法檢測(cè)不同劑量LPS作用SW480后Syndecan-1表達(dá)變化。

11、 5、Dot-blot檢測(cè)各組細(xì)胞和培養(yǎng)上清Syndecan-1蛋白水平的變化。 6、細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)不同組粘附力改變。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以x±S表示，進(jìn)行單向方差分析；Dot-blot結(jié)果進(jìn)行多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)；P<0．05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、Syndecan-1在腸粘膜組織中的表達(dá)：在不同疾病腸粘膜組織中，Syndecan-1表達(dá)

12、有明顯差異。在IBD患者腸粘膜組織中，上皮細(xì)胞表面表達(dá)減少，間質(zhì)表達(dá)增多，血清中游離Syndecan-1水平明顯升高。而在低分化腺癌中，Syndecan-1表達(dá)呈缺失狀態(tài)。 2、Syndecan-1在不同腸上皮細(xì)胞的表達(dá)：SW480細(xì)胞高表達(dá)Syndecan-1分子，HT-29細(xì)胞表達(dá)少量Syndecan-1分子，Lovo細(xì)胞基本不表達(dá)Syndecan-1分子。 3、不同濃度TNF-α作用下SW480細(xì)胞表達(dá)Syndec

13、an-1的趨勢(shì)變化：隨著TNF-α濃度增加，Syendecan-1的表達(dá)熒光強(qiáng)度由強(qiáng)漸弱。TNF-α對(duì)Syndecan-1表達(dá)呈劑量依賴性。各組間F=73．498，P＝0．000，差異有顯著性意義。進(jìn)一步做多重比較對(duì)照組（0ng/ml組）和2．5ng/ml組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P=1．000），而其他的各組間差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．000）。 4、不同濃度LPS作用下SW480表達(dá)Syndecan-1的趨勢(shì)變化：在未加

14、LPS組（即0ng/ml組），可見(jiàn)Syndecan-1膜表達(dá)明顯，隨著濃度增加，熒光減弱，到104ng/ml組，熒光幾乎不能檢測(cè)，可見(jiàn)LPS對(duì)Syndecan-1表達(dá)的影響呈劑量依賴性。各組間F=106．300，P=0．000，差異有顯著性意義。進(jìn)一步做多重比較103ng/ml組和104ng/ml組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P=0．066），而其他的各組間差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0ng/ml組vs10ng/ml組，P=0．003；0ng/m

15、l組vs其他組，P=0．000。 5、不同濃度LPS作用下腸上皮細(xì)胞Syndecan-1脫落的變化：隨LPS濃度增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清中Syndecan-1蛋白呈逐漸增多趨勢(shì)，處理組IOD比值高于對(duì)照組，各組間差異有顯著性意義，X2=12．321，v=4，P=0．015。104ng/ml組上清中蛋白表達(dá)量最高，103ng/ml組和102ng/ml組次之。 6、不同濃度LPS作用后腸上皮細(xì)胞同質(zhì)粘附力改變：隨著LPS劑量的遞增

16、，細(xì)胞與細(xì)胞之間粘附力下降。各組間F=264．364，P=0．000，差異有顯著性意義，進(jìn)一步做多重比較。對(duì)照組（即未加LPS組）和10ng/ml組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P=0．984），而與其他的各組差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．000） 結(jié)論: 1、在IBD患者的腸粘膜組織中，Syndecan-1蛋白在膜表達(dá)較正常減低，而間質(zhì)表達(dá)增多，血清中游離Syndecan-1較正常對(duì)照組明顯增多，表明Syndecan-1脫落

17、增加與IBD發(fā)生相關(guān)。 2、促炎因子TNF-α和細(xì)菌內(nèi)毒素LPS對(duì)腸上皮細(xì)胞Syndecan-1表達(dá)呈劑量依賴性，隨著TNF-α和LPS濃度增高，腸上皮細(xì)胞表面Syndecan-1表達(dá)減少，而腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中游離Syndecan-1逐漸增加，說(shuō)明細(xì)菌感染和促炎因子可促進(jìn)Syndecan-1的脫落。 3、LPS刺激后，腸上皮細(xì)胞粘附力亦隨之下降，并呈劑量依賴性。 4、腸道細(xì)菌和炎癥因子可能通過(guò)增強(qiáng)Syndeca