SRY在動(dòng)脈粥樣硬化和Tirofiban在腎缺血再灌注中的作用機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述。
　　第一部分 SRY基因在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及機(jī)制
　　目的：
　　本研究擬以人群研究、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分析及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為研究方法，分析血中游離微泡所含SRY DNA對(duì)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的影響及其在動(dòng)脈粥樣硬化病理過程中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　分析男性冠心病患者SRY DNA基因拷貝數(shù)(gene copy number，GCN)的變化情況
　　本部分實(shí)驗(yàn)以正常男性

2、及男性冠心病患者的血液樣本為研究對(duì)象，利用PCR、DNA測序技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡法等技術(shù)手段，分析SRY DNA基因拷貝數(shù)的在不同人群的改變情況。
　　研究微泡中SRY DNA的轉(zhuǎn)移性及功能
　　本部分實(shí)驗(yàn)構(gòu)建SRY-HEK293細(xì)胞株，分析SRY-HEK293來源的微泡對(duì)單核細(xì)胞黏附蛋白CD11-a及內(nèi)皮細(xì)胞黏附蛋白ICAM-1表達(dá)的作用，SRY蛋白對(duì)CD11-a及ICAM-1基因啟動(dòng)子的調(diào)控作用，SRY微泡對(duì)單

3、核細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞粘附的作用。
　　研究微泡中SRY DNA對(duì)ApoE敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的作用。
　　本部分實(shí)驗(yàn)將利用ApoE敲除小鼠，分析SRY微泡對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響，以及對(duì)小鼠單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞粘附蛋白CD11-a及ICAM-1表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　在該部分實(shí)驗(yàn)中，我們首先證實(shí)了男性血漿微泡中存在SRY DNA，且男性冠心病人血漿微泡中SRY基因拷貝數(shù)顯著的高于正常男性。而男性冠心病患者白細(xì)

4、胞SRY的基因拷貝數(shù)、mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)同樣均顯著的高于來源于正常男性的白細(xì)胞(P＜0.05)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，男性冠心病患者白細(xì)胞上黏附因子CD11-a的蛋白表達(dá)顯著的高于對(duì)照人群(P＜0.05)。
　　為分析微泡中SRY DNA的功能，本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了表達(dá)SRY基因的HEK293細(xì)胞并對(duì)該細(xì)胞系微泡中的SRY DNA進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，SRY-HEK293細(xì)胞分泌微泡中存在SRY DNA及蛋白的表達(dá)。SRY微泡可顯著的增

5、高單核細(xì)胞粘附因子CD11-a及內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子ICAM-1的蛋白表達(dá)(P＜0.05)。SRY蛋白與CD11-a及ICAM-1啟動(dòng)子均有結(jié)合，提示SRY對(duì)CD11-a及ICAM-1的調(diào)節(jié)作用存在于轉(zhuǎn)錄水平，并進(jìn)一步增加了THP-1細(xì)胞與HUVECs細(xì)胞的粘附作用(P＜0.05)。
　　進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物水平驗(yàn)證之前的結(jié)構(gòu)。利用血管組織的油紅O染色及組織H/E染色，對(duì)斑塊形成情況進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn):使用SRY微泡注射可顯著增大動(dòng)脈粥

6、樣斑塊的面積，加重血管壁上的脂質(zhì)沉積。而ELISA實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，SRY微泡顯著的增高了ApoE敲除小鼠單核細(xì)胞CD11-a及血管ICAM-I的蛋白表達(dá)。(P＜0.05)
　　結(jié)論：
　　男性血漿微泡中存在SRY DNA，且男性冠心病人血漿微泡及白細(xì)胞中SRY基因表達(dá)及功能均顯著高于正常男性。
　　SRY微泡通過調(diào)節(jié)粘附因子CD11-a及ICAM-1調(diào)節(jié)了單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附作用。
　　SRY微泡通過調(diào)節(jié)單核細(xì)

7、胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附作用參與了血管動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病。
　　第二部分 Tirofiban在腎缺血再灌注中的作用機(jī)制
　　目的:
　　研究Tirofiban對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷(ischemia-reper fusion injury，RIRI)的影響，然后從腎臟組織功能、腎組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、腎組織超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性、缺血再

8、灌注后腎臟組織病理改變等方面探討Tirofiban腎臟保護(hù)作用的作用以及機(jī)制。
　　方法:
　　隨機(jī)選取20只雄性SD大鼠，體重平均為250-260g，隨機(jī)性分為四
　　組:假手術(shù)組(control)、假手術(shù)+Tirofiban干預(yù)組（T組）、腎缺血再灌注組（IR組）和腎缺血再灌注+Tirofiban干預(yù)組（IR+T組），每組5只。切除其右側(cè)腎臟組織，無創(chuàng)性動(dòng)脈夾夾閉大鼠左側(cè)腎動(dòng)脈45min后，去掉無創(chuàng)動(dòng)脈夾恢復(fù)腎臟組

9、織血流供應(yīng)的方法建立大鼠腎缺血再灌注24h模型。control組:打開腹腔，分離腎蒂周圍組織，但不
　　夾閉雙側(cè)腎蒂;T組:假手術(shù)組給予Tirofiban(劑量為200μg/kg) IR夾閉右腎動(dòng)靜脈45min，給予再灌注，縫合24h后取材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。IR+T組:腎臟缺血即夾閉左側(cè)腎蒂前15min給予同等劑量Tirofiban。造模成功24h后收集各處理組血清及腎組織標(biāo)本，檢測各組大鼠肌酐SCR、LDH、MDA、SOD、腎組織中ba

10、x和bcl-2表達(dá)及Bax/Bcl-2比值比，腎組織中凋亡細(xì)胞的檢測等含量的指標(biāo)變化，行HE染色觀察光鏡下腎組織
　　病理學(xué)結(jié)果，電鏡檢測腎缺血再灌注損傷以后腎臟結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.Tirofiban能改善腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腎功能衰竭
　　首先，我們建立SD大鼠腎缺血再灌注損傷模型，觀察Tirofiban對(duì)腎缺血再灌注造成腎臟功能損傷的相對(duì)應(yīng)保護(hù)及其作用機(jī)制。腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致SD大鼠血AST

11、、尿素氮和血肌酐水平明顯升高，腎功能嚴(yán)重受損，同時(shí)腎組織病理切片(HE染色)可見腎小管上皮細(xì)胞損傷明顯，空泡樣變性、壞死，管腔擴(kuò)張，腎小管和腎組織中有較多的血管充血和出血點(diǎn)，紅細(xì)胞聚集以及明顯壞死性沉淀，可看到腎小球變性，腎臟間質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重水腫，腫脹壞死變性明顯形成，管腔內(nèi)內(nèi)出現(xiàn)管型嗜酸性粒細(xì)胞。給予Tirofiban預(yù)保護(hù)后，血AST、尿素氮和血肌酐水平顯著下降，并且病理學(xué)評(píng)
　　分降低，病理切片提示只有少量細(xì)胞壞死，腎小管損傷程

12、度明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤不明顯，單純性腎間質(zhì)水腫和充血為主。通過血清學(xué)指標(biāo)和組織病理學(xué)評(píng)分初步證實(shí)Tirofiban對(duì)腎缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。
　　2.Tirofiban能減少腎缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡
　　為進(jìn)一步分析腎組織中細(xì)胞凋亡水平變化，我們采用了TUNEL染色和凋亡蛋白免疫印跡的方法。TUNEL染色提示control組僅見極少數(shù)散在的凋亡細(xì)胞;IR組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著，外髓區(qū)遠(yuǎn)曲小管分布較多，其余

13、少量分布于皮質(zhì)腎小管，也可見部分脫落進(jìn)入到腎小管內(nèi);IR+T組可見少量的TUNEL陽性細(xì)胞。同時(shí)，與control組相比，IR后凋亡蛋白caspase-3和Bax蛋白水平增加，Bcl-2水平則降低，給予Tirofiban干預(yù)后相比，caspase-3和Bax蛋白水平顯著下降，Bcl-2水平則升高，再次證實(shí)腎缺血再灌注損傷后Tirofiban可減少細(xì)胞凋亡。
　　3.Tirofiban能減輕腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)

14、　　為了揭示Tirofiban對(duì)腎IRI的保護(hù)機(jī)制，我們檢測了SD大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，進(jìn)行血清SOD、GSH、MDA、MPO和炎性因子（IL-1β和TNF-β）檢測。與IR組相比，IR+T組可顯著降低缺血再灌注大鼠血清MDA、MPO和炎性因子（IL-1β和TNF-β）水平，同時(shí)可顯著提高SOD和GSH水平，降低MDA、MPO和IL-1β、TNF-β水平，提示Tirofiban可能通過氧化應(yīng)激環(huán)節(jié)發(fā)揮其保護(hù)作用。
　　4.Tiro

15、fiban通過對(duì)NO途徑發(fā)揮對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　我們分析了一氧化氮合酶和氧化應(yīng)激關(guān)系，既往研究提示腎臟氧化應(yīng)激水平與一氧化氮合酶有密切關(guān)系。為了明確NO是否在Tirofiban對(duì)腎缺血再灌注損傷保護(hù)作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，檢測了內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)水平，在IR組和IR+T組，兩者的變化趨勢相反。
　　為了明確eNOS和iNOS的作用，采用腎臟內(nèi)皮細(xì)胞(NRK52E細(xì)胞株)建

16、立缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型，分別加入eNOS和iNOS的抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲基酯（L-NAME）和甲基異硫脲(SMT)，L-NAME可明顯阻斷Tirofiban對(duì)腎臟內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。這一結(jié)果證實(shí)在腎臟缺血再灌注損傷過程中，Tirifiban通過對(duì)eNOS的調(diào)控發(fā)揮其對(duì)腎臟的保護(hù)作用。
　　結(jié)論:
　　1.Tirofiban能夠改善腎臟缺血再灌注所致的腎臟損傷，有助于腎臟功能恢復(fù)。
　　2.Tirofiban對(duì)缺血再