人巨細(xì)胞病毒對(duì)早孕絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞免疫功能影響的體外研究.pdf

1、第一部分T細(xì)胞免疫對(duì)感染HCMV的絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞保護(hù)作用研究
　　【目的】體外研究T細(xì)胞對(duì)感染HCMV的絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的免疫效應(yīng)。
　　【方法】①選擇人早孕胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞株HPT-8進(jìn)行研究,建立感染HCMV的HPT-8細(xì)胞模型:以100TCID50HCMV攻擊HPT-8細(xì)胞后,應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)HCMVpp65抗原表達(dá)及病毒滴定法觀察HPT-8感染情況并繪制生長(zhǎng)曲線,判定HPT-8細(xì)胞對(duì)HCMV的易感性,

2、感染狀態(tài)以及HCMV在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)情況。②收集門診孕前咨詢健康婦女外周血,提取外周血單個(gè)核細(xì)胞,尼龍毛柱法分離純化獲得T細(xì)胞。③建立T細(xì)胞與感染HCMV的HPT-8細(xì)胞共培養(yǎng)模型,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HPT-8細(xì)胞內(nèi)HCMVDNA負(fù)荷量。
　　【結(jié)果】①加入HCMV48h后,HPT-8細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量HCMVpp65抗原信號(hào);感染3d后的HPT-8細(xì)胞培養(yǎng)液(Trophoblastconditionedmedium,TCM

3、)可使HEL細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變;HCMV在HPT-8細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制于第4d開始增高,6d達(dá)到高峰。②T細(xì)胞具有下調(diào)HPT-8細(xì)胞內(nèi)HCMVDNA負(fù)荷量的作用(p<0.05);T細(xì)胞與感染的HPT-8細(xì)胞共培養(yǎng)3d后的細(xì)胞上清,也具有下調(diào)HPT-8細(xì)胞內(nèi)HCMVDNA負(fù)荷量的作用(p<0.05);共培養(yǎng)3天后的T細(xì)胞則失去了下調(diào)HPT-8細(xì)胞內(nèi)HCMVDNA負(fù)荷量的作用(p>0.05)。
　　【結(jié)論】T細(xì)胞在母-胎界面HCMV感染初期具

4、有一定的免疫防御作用,其機(jī)制可能與T細(xì)胞的直接溶解殺傷作用及其分泌的細(xì)胞因子相關(guān);但T細(xì)胞的免疫功能很快受到抑制,其中的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　第二部分HCMV感染后絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞分泌產(chǎn)物對(duì)外周血T細(xì)胞Treg/Th17平衡的影響
　　【目的】體外研究HCMV感染后絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞分泌產(chǎn)物對(duì)外周血T細(xì)胞Treg/Th17平衡的影響
　　【方法】①選擇人早孕胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞株HPT-8進(jìn)行研究,建立感染HCMV的

5、HPT-8細(xì)胞模型。②尼龍毛柱法分離純化獲得T細(xì)胞。③建立TCM與T細(xì)胞共培養(yǎng)體系:100TCID50HCMV攻擊HPT-8細(xì)胞后,收集HCMV感染72h以及相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組的TCM,過濾離心后紫外燈照射15min滅活HCMV;根據(jù)T細(xì)胞培養(yǎng)液組分的不同,分為感染組(HCMV感染72h的TCM)、TCM對(duì)照組(對(duì)照組的TCM)及空白對(duì)照組(不含TCM),置于CO2培養(yǎng)箱(5％CO2、37℃)中繼續(xù)培養(yǎng)72h。④應(yīng)用流式分析法檢測(cè)HCMV

6、感染后絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞分泌產(chǎn)物對(duì)T細(xì)胞內(nèi)CD4+CD25+CD127-/CD4+、CD4+IL17A+/CD4+比值的影響。⑤應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HCMV感染后絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞分泌產(chǎn)物對(duì)T細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、IL-6、IL-17A、TGF-β及RORγtmRNA表達(dá)的影響;⑥應(yīng)用ELISA法檢測(cè)各組T細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β、IL-17A的濃度。
　　【結(jié)果】①與空白對(duì)照組相比,TCM對(duì)照組Treg/Th1

7、7比值增高(p<0.01);與TCM對(duì)照組相比,感染組Treg/Th17比值降低(p<0.01)。②與空白對(duì)照組比較,TCM對(duì)照組T細(xì)胞內(nèi)Foxp3,RORγt及TGF-βmRNA的表達(dá)均明顯升高(p<0.01);與TCM對(duì)照組比較,感染組T細(xì)胞內(nèi)Foxp3,RORγt及TGF-βmRNA表達(dá)均明顯減少(p<0.01)。③與空白對(duì)照組相比,TCM對(duì)照組T細(xì)胞內(nèi)IL-17A和IL-6mRNA的表達(dá)均明顯降低(p<0.01)。與TCM對(duì)照組

8、相比,感染組T細(xì)胞內(nèi)IL-17A和IL-6mRNA的表達(dá)均明顯增加(p<0.01)。④與空白對(duì)照組相比,TCM對(duì)照組上清中TGF-β1濃度增加(p<0.01);與TCM對(duì)照組比較,感染組上清中TGF-β1濃度減少(p<0.01)。⑤與空白對(duì)照組相比,TCM組上清中IL-17A濃度減少(p<0.01);和TCM對(duì)照組相比,感染組IL-17A的濃度增加(p<0.01)。
　　【結(jié)論】絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞分泌物可促使外周血T細(xì)胞Treg/

9、Th17型免疫平衡向Treg細(xì)胞偏倚,有利于妊娠的維持,而HCMV可能通過影響絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞合成及分泌功能從而使外周血T細(xì)胞內(nèi)Treg/Th17平衡向Th17細(xì)胞偏倚,導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局。
　　第三部分HCMV感染對(duì)絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞合成分泌VIP表達(dá)水平的影響
　　【目的】體外研究HCMV對(duì)絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞合成分泌血管活性腸肽(vasoactiveintestinalpeptide,VIP)表達(dá)水平的影響
　　【

10、方法】①選擇人早孕胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞株HPT-8進(jìn)行研究,建立感染HCMV的HPT-8細(xì)胞模型。②收集HCMV感染72h以及相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組的細(xì)胞及TCM,TCM過濾離心后紫外燈照射15min滅活HCMV。③應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HCMV感染對(duì)HPT-8細(xì)胞VIPmRNA表達(dá)水平的影響。④應(yīng)用免疫細(xì)胞組織化學(xué)及免疫印跡法檢測(cè)HCMV感染對(duì)HPT-8細(xì)胞VIP蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。⑤應(yīng)用ELISA法檢測(cè)HCMV感染對(duì)HPT-8細(xì)胞分泌

11、VIP濃度的影響。
　　【結(jié)果】①與空白對(duì)照組相比,感染組HPT-8細(xì)胞VIPmRNA表達(dá)水平明顯降低(p<0.01)。②空白對(duì)照組及感染組HPT-8細(xì)胞的胞質(zhì)和胞漿均有VIP蛋白表達(dá),呈棕黃色顆粒;感染組HPT-8細(xì)胞VIP蛋白表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組(p<0.01)。③感染組HPT-8細(xì)胞分泌VIP濃度明顯低于空白對(duì)照組(p<0.01)。
　　【結(jié)論】母-胎界面HCMV感染抑制了絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞合成和分泌的VIP表達(dá)

12、水平。
　　第四部分黃芩素對(duì)感染HCMV的絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞VIP表達(dá)水平的影響
　　【目的】探討黃芩素阻斷HCMV感染絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的作用及對(duì)HCMV感染的絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞VIP表達(dá)水平的影響。
　　【方法】①選擇人早孕胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞株HPT-8進(jìn)行研究,建立感染HCMV的HPT-8細(xì)胞模型。②收集HCMV感染72h以及相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組、黃芩素組的HPT-8細(xì)胞及TCM,TCM過濾及離心后用紫外燈照射15mi

13、n滅活HCMV。③應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)黃芩素對(duì)感染HCMV的HPT-8細(xì)胞HCMVDNA負(fù)荷量的影響。④應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)黃芩素對(duì)感染HCMV的HPT-8細(xì)胞內(nèi)VIPmRNA表達(dá)的影響。⑤應(yīng)用免疫細(xì)胞組織化學(xué)及免疫印跡法檢測(cè)黃芩素對(duì)感染HCMV的HPT-8細(xì)胞內(nèi)VIP蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。⑥ELISA法檢測(cè)黃芩素對(duì)感染HCMV的HPT-8細(xì)胞分泌VIP濃度的影響。
　　【結(jié)果】①黃芩素減少感染的HPT-8細(xì)胞內(nèi)H