低分子肝素體外抗人巨細胞病毒作用的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 采用人胚成纖維細胞(HF)培養(yǎng)技術(shù),對低分子肝素(LMWH)體外抗人巨細胞病毒(HCMV)藥物實驗進行研究,探討LMWH體外對HCMV的抑制作用。
　　 方法:
　　 1.測定HCMV AD169對HF細胞的毒力將病毒培養(yǎng)懸液用DMEM液按10倍遞次法稀釋成(10－1～10－8)的不同稀釋度,每濃度設8復孔。向預先培養(yǎng)成單層的HF細胞加入不同濃度的HCMV液,同時設不加病毒的正常HF細胞對照組,置于

2、37℃、5％CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。逐日觀察CPE,記錄細胞的病變孔數(shù),等細胞病變不再進行時,根據(jù)Reed-Muench法計算TCID50。CPE超過50％即(++)以上計為病變孔,(++)以下則計為非病變孔。
　　 2.測定藥物對HF細胞的毒性按倍比遞次稀釋法,將7種不同濃度的LMWH及陽性對照藥物GCV分別加入已長成單層的HF細胞培養(yǎng)板中,每濃度設8復孔,同時設不加藥物的正常HF細胞對照組。同樣置于37℃、5％/CO2恒溫箱內(nèi)培

3、養(yǎng)。每日倒置顯微鏡下觀察記錄兩種藥物對HF細胞的病變效應,連續(xù)觀察5～7d待細胞病變不再繼續(xù)時,用MTT比色法測定A490值。使用Probit回歸法分別計算出低分子肝素及陽性對照藥物GCV對HF細胞的半數(shù)中毒濃度(TC50)。
　　 3.藥物體外對病毒增殖的抑制作用根據(jù)病毒復制周期,設計三種抗病毒作用方式來觀察LMWH對HCMV的抑制作用。先用DMEM液將HCMV稀釋成100TCID50/0.1 ml備用。設立從TCo開始按倍比

4、稀釋成的7個濃度的LMWH組和GCV組,以及病毒對照組(Virus control group,VCG)與正常細胞對照組(Normal cell control group,NCG),各組均設4復孔。采用下列加藥方式進行實驗:1.增殖抑制法將HF細胞以病毒懸液吸附2h后,棄去病毒液后加入不同藥物；2.感染阻斷法HF細胞加藥物培養(yǎng)2h,棄去含藥物的維持液后加入HCMV感染；3.直接殺滅法藥物與HCMV共同置于恒溫箱中2h后再感染HF細胞,

5、2h后更換成維持液培養(yǎng)。各實驗組細胞繼續(xù)置37℃、5％CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng),逐日倒置顯微鏡下觀察記錄CPE結(jié)果。待病毒對照組病變達+++～++++時,采用MTT比色法測定A490值。計算細胞存活率(CSR)和藥物的病毒抑制率(IR),并使用Probit回歸法求得兩種藥物對HCMV的半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　 結(jié)果：
　　 1.將病毒原液行連續(xù)10倍遞次稀釋后,本實驗測得HCMV AD169病毒株的TCID50=10－

6、4.67/0.1ml。
　　 2.用MTT比色法測定LMWH和GCV對HF細胞的TC0分別為2500mg/L,800 mg/L。計算出對HF細胞的TC50分別為2261.7 mg/L、1685.23mg/L。
　　 3.三種不同藥物加入方式下,方式1中GCV組能明顯抑制HCMV所致CPE,方式2和3中LMWH能不同程度抑制HCMV所致CPE。方式I加藥,各濃度GCV平均A490值與病毒對照組比較,均有統(tǒng)計學差異(P<0.

7、05),方式2和3中幾乎各濃度平均A490值與病毒對照組比較,均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。而對于LMWH而言,加藥方式1中平均.A490值與病毒對照組比較,均無統(tǒng)計學差異(P>0.05),方式2和3中幾乎各濃度LMWH的平均A490值與病毒對照組比較,均有統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01)。實驗所設病毒對照組均可見典型CPE,正常細胞對照組均無明顯病變。
　　 4.MTT法測定正常細胞對照組及病毒對照組平均A490值分

8、別為0.386±0.024和0.045±0.0021。三種藥物加入方式下,方式1中GCV的IC50、TI分別為35.26mg/L和47.8。方式2和3中,LMWH的IC50、TI分別為2016.9 mg/L、1.12和555.46 mg/L、4.07。
　　 5.以藥物濃度為橫坐標,病毒抑制率為縱坐標繪出不同藥物加入方式下的劑量-效應關(guān)系圖。方式1中GCV對HCMV的抑制作用隨濃度升高而增強,存在明顯的量效關(guān)系。而方式2和3中L