過表達(dá)小麥泛素基因Ta-Ub2加快煙草發(fā)育進(jìn)程機(jī)制的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)作為生物體細(xì)胞的組成成分以及生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，其合成和降解對(duì)生物體具有十分重要的意義。蛋白質(zhì)降解主要通過兩種途徑：溶酶體降解以及需能的泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-26S Proteasome System，UPS)。UPS在泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)的共同作用下，將76個(gè)氨基酸組成的標(biāo)簽蛋白泛素(Ubiquitin，Ub)結(jié)合到底物蛋白上。標(biāo)記后的蛋白被蛋白酶體降解或者進(jìn)行信號(hào)

2、通路的調(diào)節(jié)。通過對(duì)底物蛋白進(jìn)行不同形式的泛素化修飾，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞程序性死亡等。
　　 近年來的研究表明，UPS參與調(diào)節(jié)幾乎所有的植物生長(zhǎng)發(fā)育過程，但是以前的研究主要集中在E3的作用上，對(duì)泛素在這些過程中的作用，報(bào)道較少。實(shí)驗(yàn)室之前獲得了過表達(dá)小麥泛素基因Tα-Ub2的轉(zhuǎn)基因煙草，初步觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的表型變化較大，但是過量表達(dá)Tα-Ub2引起轉(zhuǎn)基因植株表型變化的機(jī)制不清楚。本研究首先通過

3、基因組PCR和半定量RT-PCR的方法鑒定了T-2、T-11兩個(gè)株系用做實(shí)驗(yàn)材料，研究泛素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的作用，及其生理與分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)表型觀察與結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示，過量表達(dá)Tα-Ub2的轉(zhuǎn)基因煙草T-2和T-11相對(duì)于野生型煙草表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)加快，開花提前。轉(zhuǎn)基因煙草的花期相對(duì)野生型煙草提前約30天。
　　 (2)為進(jìn)一步明確煙草的發(fā)育狀況，用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)的方法檢測(cè)煙草的發(fā)育

4、標(biāo)記基因(NtMADS-4、NtMADS-11)的表達(dá)，以在分子水平上確定轉(zhuǎn)基因和野生型煙草發(fā)育時(shí)期的差異。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草NtMADS-11的表達(dá)量與遲后30天的野生型煙草相似，進(jìn)一步在分子水平上說明過表達(dá)Tα-Ub2加快了煙草的發(fā)育進(jìn)程。
　　 (3)用蛋白免疫方法檢測(cè)了開花期的野生型煙草泛素蛋白的含量變化，結(jié)果表明，伴隨著煙草頂端發(fā)育過程，頂端組織泛素水平變化明顯，暗示泛素參與煙草頂端發(fā)育過程。
　　 (4)提前

5、抽薹是轉(zhuǎn)基因煙草最顯著的性狀，同時(shí)可能是生長(zhǎng)加快、提前開花的原因，而GA在植物抽薹過程中具有重要作用。我們用高效液相色譜的方法測(cè)定了轉(zhuǎn)基因煙草葉片和莖尖的總赤霉素(GA)的含量，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草的總GA含量均高于野生型或與野生型煙草持平。考慮到總GA包括GA前體、活性GA以及無活性的GA，進(jìn)一步地用酶聯(lián)免疫法測(cè)定了活性GA含量，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草葉片和莖尖的GA3和GA4水平均高于野生型。
　　 (5)外源施加GA3使野生型煙

6、草的抽薹提前，并且使野生型煙草表現(xiàn)為類似轉(zhuǎn)基因煙草的表型。進(jìn)一步說明轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)的GA的含量增加可能是造成了抽薹提前的原因。
　　 (6)GA的生物合成與代謝是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中許多關(guān)鍵酶在GA代謝以及活性GA水平控制中具有重要作用，包括GA20氧化酶、GA3氧化酶以及GA2氧化酶。我們用qRT-PCR的方法在煙草發(fā)育過程中幾個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)了GA20氧化酶、GA3氧化酶以及GA2氧化酶的表達(dá)水平，結(jié)果顯示過表達(dá)Tα-Ub