泛素基因在煙草耐鹽性中的作用及其生理機(jī)制研究.pdf

1、在生物細(xì)胞生命周期中不斷有新的功能蛋白產(chǎn)生，與此同時(shí)也必然伴有結(jié)束其生命功能的蛋白質(zhì)的降解。蛋白質(zhì)的降解與其合成過(guò)程一樣，對(duì)植物的生理代謝和生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解受到精確的時(shí)間和空間調(diào)節(jié)，并具有高度選擇性。泛素/26S蛋白酶體途徑(ubiquitin/26S protcasome pathway，UPP)是目前已知最重要的、有高度選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑。在這個(gè)途徑中，泛素用來(lái)標(biāo)記需要降解的蛋白質(zhì)，被標(biāo)記的靶蛋白進(jìn)而被

2、26S蛋白酶體識(shí)別并降解。逆境脅迫下生物細(xì)胞內(nèi)無(wú)功能蛋白質(zhì)的積累增多，及時(shí)清除這些無(wú)功能蛋白質(zhì)成為生物適應(yīng)逆境的重要方式。已有研究表明，泛素基因在逆境條件下表達(dá)顯著增加，短命調(diào)節(jié)蛋白及異常蛋白降解速率加快，間接說(shuō)明泛素系統(tǒng)在生物逆境適應(yīng)中的作用。但過(guò)量表達(dá)泛素基因以及抑制泛素基因表達(dá)對(duì)植物逆境適應(yīng)性的影響及其生理機(jī)制研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆了小麥單體泛素基因，構(gòu)建了正義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草獲得了過(guò)量表達(dá)泛素基因的轉(zhuǎn)基因株

3、系多個(gè)，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)泛素提高了煙草的抗旱性、耐鹽性。同時(shí)克隆了煙草的泛素基因，構(gòu)建了反義表達(dá)載體，反義轉(zhuǎn)化煙草獲得了抑制煙草泛素基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系。本論文以正義轉(zhuǎn)基因煙草及抑制泛素基因表達(dá)的反義轉(zhuǎn)基因煙草為材料，研究調(diào)控泛素系統(tǒng)對(duì)植物抗逆性的影響。從種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)狀況、膜傷害程度、活性氧積累與清除、離子平衡及光合能力等方面分析了泛素系統(tǒng)影響植物抗逆性的生理生化機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)泛素單體增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性，抑制泛素基

4、因的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株抗鹽性減弱。主要結(jié)果如下： 1、泛素蛋白豐度檢測(cè)結(jié)果表明，過(guò)量表達(dá)泛素基因或抑制泛素基因表達(dá)對(duì)于轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞內(nèi)泛素單體蛋白豐度影響不大；過(guò)量表達(dá)泛素蛋白會(huì)使結(jié)合態(tài)泛素蛋白含量增加，鹽脅迫下這種增加更為明顯；抑制泛素基因表達(dá)會(huì)降低結(jié)合態(tài)泛素蛋白的積累。 2、正常生長(zhǎng)條件下，過(guò)量表達(dá)Ta-Ub2泛素基因?qū)ΨN子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)就有促進(jìn)作用；抑制Nt-Ub1泛素基因?qū)ΨN子萌發(fā)和植株的生長(zhǎng)有延緩作用。鹽脅

5、迫導(dǎo)致種子萌發(fā)延遲及幼苗生長(zhǎng)抑制，過(guò)量表達(dá)Ta-Ub2泛素基因能促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)，緩解鹽脅迫導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制，轉(zhuǎn)基因煙草抗鹽性增強(qiáng)：抑制泛素基因表達(dá)使種子萌發(fā)推遲，加劇了鹽脅迫下的生長(zhǎng)抑制。 3、鹽脅迫會(huì)破壞生物膜的穩(wěn)定性和完整性，導(dǎo)致活性氧積累及膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量的增加，膜透性增強(qiáng)。過(guò)量表達(dá)泛素基因的轉(zhuǎn)基因植株中主要抗氧化酶的活性增強(qiáng)，活性氧積累減少，MDA含量及電解質(zhì)外滲量較低，有效保護(hù)了生物膜的穩(wěn)定性和

6、完整性；抑制泛素基因表達(dá)導(dǎo)致鹽脅迫下生物膜的損傷更為嚴(yán)重。 4、鹽脅迫不僅會(huì)造成滲透脅迫，還會(huì)引起離子毒害。過(guò)量表達(dá)Ta-Ub2泛素基因能使轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下保持較好的水分狀況，并有效維持體內(nèi)的離子平衡，進(jìn)而提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性：抑制泛素基因加劇了鹽脅迫對(duì)于植物體造成的滲透脅迫和離子毒害作用，抗鹽性降低。 5、鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物光合機(jī)構(gòu)受到損傷，表現(xiàn)為色素含量降低、PSII光化學(xué)效率下降。過(guò)量表達(dá)Ta-Ub2泛素基因

7、的轉(zhuǎn)基因植株碳同化速率、PSII光化學(xué)效率的下降及色素降解速率相對(duì)緩慢，鹽脅迫下能維持較高的光合作用效率；抑制泛素基因表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株光合能力降低。 6、對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)活性氧積累進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抑制泛素基因表達(dá)會(huì)加劇轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)活性氧的積累，而過(guò)量表達(dá)泛素基因的植株體內(nèi)積累活性氧較少。推測(cè)活性氧積累的不同可能是不同轉(zhuǎn)基因植株抗逆性差異的原因之一，泛素系統(tǒng)與活性氧清除有關(guān)。用外源甲基紫精處理，造成氧化脅迫，檢測(cè)了不同轉(zhuǎn)基因煙草耐

8、氧化脅迫的能力，證明過(guò)量表達(dá)泛素提高了煙草的耐氧化脅迫能力；而反義抑制泛素表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的耐氧化脅迫能力較野生型差，進(jìn)一步證明了泛素水平與耐氧化脅迫有關(guān)。 7、過(guò)量表達(dá)Ta-Ub2泛素基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)綜合脅迫(高鹽+高溫+高光強(qiáng))的抗性，并加速了植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，使轉(zhuǎn)基因植株花期提前。反義抑制泛素基因表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)早衰及灼傷斑點(diǎn)，抗逆性降低。 綜上所述，過(guò)量表達(dá)泛素單體提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鹽脅迫甚至綜合脅迫