SsNHXI基因在紫花苜蓿中的表達(dá)及其耐鹽性研究.pdf

1、本研究應(yīng)用RACE方法成功的從鹽生植物-豬毛菜(Salsola soda)中克隆了液泡膜型Na+／H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全基因序列,構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化紫花苜蓿,并對獲得大量轉(zhuǎn)基因苜蓿材料進(jìn)行了耐鹽性研究。
　　 豬毛菜液泡膜型Na+／H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全基因(SsNHX1)序列全長為1934 bp,包含一個(gè)長度為1680 bp的開放閱讀框(open reading frame,ORF),編碼559 aa個(gè)氨基酸殘基。液泡膜

2、型Na+／H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高度保守區(qū)-抑制劑氨氯吡嗪脒結(jié)合位點(diǎn),Na+／H+交換泵(Na+／H+exchanger；NHE)和液泡膜型Na+／H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特有的12段跨膜疏水結(jié)構(gòu)域在蛋白序列中被發(fā)現(xiàn)。氨基酸序列多重比對分析表明,該蛋白與來自鹽爪爪(Kalidium foliatum)、北濱藜(Atriplex gmelini)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、棉花(Gossypium hirsutum)、擬南芥(Ara

3、bidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、大麥(Hordeum vulgare)和玉米(Zea mays)的液泡膜型Na+／H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相比,相似性分別達(dá)到了90％,87％,77％,76％,75％,74％,73％和72％。進(jìn)化樹分析表明,該蛋白與其他液泡膜型Na+／H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親緣關(guān)系較近,而與質(zhì)膜型Na+／H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在液泡膜型Na+／H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中,與鹽生植物-鹽爪爪、北濱

4、藜親緣關(guān)系較近,而與甜土植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該基因在酵母中表達(dá)能夠提高酵母的生長速率,在煙草中表達(dá)能夠有效的提高T1代轉(zhuǎn)基因種子在含鹽培養(yǎng)基中的發(fā)芽率,并且生物量和株高都比對照有明顯的提高,充分驗(yàn)證了該基因抗鹽功能?？傊?SsNHX1基因是液泡膜型Na+／H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族的一個(gè)全新成員,同時(shí),在植物中過表達(dá)此基因能夠明顯的提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽堿能力。
　　 苜蓿的基因型是影響苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素,只有很少的栽培品種適合建

5、立高效的再生體系。本研究以14份國內(nèi)外主栽品種作為供試品種,通過比較品種間的誘導(dǎo)能力,篩選到公農(nóng)1號為最佳的基因型。在此基礎(chǔ)上,以公農(nóng)1號的嫩葉為外植體,建立了一套高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系,成功將豬毛菜液泡膜型Na+／H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)胲俎；蚪M中。Southern雜交證實(shí)有6個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化系為轉(zhuǎn)基因陽性株系,最終獲得了203株陽性植株。
　　 本研究以來自6個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化系的苜蓿植株作為耐鹽試驗(yàn)材料,進(jìn)行鹽脅迫試驗(yàn)。No

6、rthern雜交證實(shí)外源基因-豬毛菜液泡膜型Na+／H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,在逆境脅迫啟動(dòng)子調(diào)控下,隨著鹽處理濃度的增高而表達(dá)量也逐漸增高。耐鹽試驗(yàn)表明,與對照相比轉(zhuǎn)基因植株具有明顯耐鹽能力,最高耐鹽能力達(dá)到400 mM,而對照在200 mM的條件下逐漸死亡。并且轉(zhuǎn)基因耐鹽植株中具有更高Na+,K+的含量。生理分析表明,在鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因耐鹽植株受到的傷害要比對照植株輕的多。轉(zhuǎn)基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)活性變化趨勢小和脯氨酸含