ABA受體與紫花苜蓿逆境相關(guān)基因表達(dá)分析研究.pdf

1、本文以紫花苜蓿不同品種(三得利、賽迪5、新牧2、WL903、WL712、WL656、WL343、WL168)為試驗(yàn)材料，研究了逆境脅迫對(duì)紫花苜蓿ABA受體與逆境相關(guān)基因的表達(dá)的影響，對(duì)ABA受體基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并對(duì)脅迫后ABA受體表達(dá)進(jìn)行了分析，同時(shí)分析了噴施外源ABA后苜蓿生理和ABA受體及逆境基因的表達(dá)。這對(duì)逆境條件下紫花苜?？剐云贩N的選擇提供了指導(dǎo)，也為今后苜蓿ABA受體在逆境中的應(yīng)用及抗逆育種提供科學(xué)依據(jù)。
　　

2、1.利用生物信息學(xué)方法，對(duì)PYL不同基因的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)等進(jìn)行推測(cè)分析。結(jié)果顯示:PYL9個(gè)基因所編碼的相應(yīng)蛋白分子量都在20-25kd范圍，其酸堿性除Medtr5g083270外都為弱酸，都為疏水性蛋白，其中Medtr4g014460和Medtr5g03050屬于疏水性穩(wěn)定蛋白質(zhì)，其它都是不穩(wěn)定疏水性蛋白質(zhì)，都不含信號(hào)肽;除Medtr5g03050和Medr1g016480無(wú)糖基化位點(diǎn)外，其它基因糖基化位點(diǎn)數(shù)有所不同，都沒(méi)有跨膜結(jié)

3、構(gòu)域。PYL多肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成，PYL三級(jí)結(jié)構(gòu)中Medtr3g071740、Medtr5g083270和Medtr4g014460及Medtr8g027805和Medtr3g090980蛋白保守結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型基本一致，其它蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)各有不同。分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系顯示，Medtr1g028380、Medtr3g090980同源關(guān)系較近，這二者又與Medtr8g027805同源關(guān)系較近。Medtr3g0

4、71740、Medtr5g083270同源關(guān)系較近，這二者又與Medtr4g014460、Medtr7g070050同源關(guān)系較近。Medtr1g016480、Medtr5g030500同源關(guān)系較近。對(duì)PYL保守結(jié)構(gòu)域分析，其編碼的蛋白質(zhì)均含有putative hydrophobic ligand binding site、protein interface和gate結(jié)構(gòu)，以及PYL特異性位點(diǎn)的多重結(jié)構(gòu)域。其基因理化性質(zhì)，蛋白結(jié)構(gòu)的相似性

5、表明它們?cè)谡{(diào)節(jié)機(jī)體某些方面共同發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，通過(guò)某種特定的方式參與機(jī)體功能的實(shí)現(xiàn)。
　　2.利用15％PEG-6000模擬滲透脅迫，4％NaCl模擬鹽脅迫，4℃模擬低溫脅迫，采用RT-PCR方法對(duì)蒺藜苜蓿和不同品種紫花苜蓿ABA受體的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果如下:15％PEG脅迫下，蒺藜苜蓿中Medtr1g016480和Medtr5g083270的表達(dá)量與CK相比顯著升高，分別提高了678.3％、99.6％、231.3％和611.4％、

6、47.6％、176.7％(P＜0.05)，其它基因變化不顯著，紫花苜蓿中WL168的表達(dá)量最高，其Medtr1g016480和Medtr5g083270在根莖葉中的表達(dá)都為根＞葉＞莖（6.10、3.04、1.79和6.51、1.89、1.67）。4％NaCl脅迫下，蒺藜苜蓿Medtr1g016480和Medtr5g083270的表達(dá)量與CK相比顯著升高，分別提高了781.3％、45.9％、269.8％和558.5％、11.2％、53.6

7、％(P＜0.05)，紫花苜蓿中WL168的表達(dá)量最高，其Medtr1g016480和Medtr5g08270在根莖葉中的表達(dá)都為根＞葉＞莖（6.13、3.01、1.98和5.91、2.63、1.51）。4℃低溫脅迫下，蒺藜苜蓿中Medtr1g016480和Medtr5g083270的表達(dá)量與CK相比顯著升高，分別提高了103.5％、14.3％、474.6％和113.8％、56.6％、557.7％(P＜0.05)，苜蓿品種中WL168基因

8、相對(duì)表達(dá)量最高，其Medtr1g016480和Medtr5g083270在根莖葉中的表達(dá)都為葉＞根＞莖(6.12、3.09、1.99和5.23、2.78、1.76)。表明ABA受體表達(dá)的主要部位在根和葉中，苜蓿ABA受體Medtr1g016480和Medtr5g083270在ABA調(diào)控系統(tǒng)中起重要作用，促進(jìn)苜蓿抵抗逆境的能力。
　　3.采用50μM的外源ABA噴施正常生長(zhǎng)的苜蓿幼苗，連續(xù)噴施5天。待處理組葉面發(fā)黃，測(cè)定處理組與對(duì)照

9、組的葉綠素含量和脯氨酸含量，采用RT-PCR方法測(cè)其ABA受體表達(dá)和逆境基因ORE1、RD29A、SAG12和SAG13的表達(dá)水平。結(jié)果表明:外源ABA處理下，WL168的葉綠素含量最高，三得利的葉綠素含量最低，TM葉綠素含量顯著低于CK，WL168的葉綠素含量下降了37.18％(P＜0.05);WL168的脯氨酸含量最高，三得利脯氨酸含量最低，TM脯氨酸含量顯著高于CK,WL168脯氨酸含量上升了84.0％(P＜0.05)。外源ABA

10、處理下，苜蓿ABA受體的表達(dá)量都顯著升高，其中Medtr1g016480、Medtr3g071740、Medtr5g030500、Medtr5g083270和Medtr7g070050的表達(dá)量顯著高于其它基因。苜蓿品種中WL168基因相對(duì)表達(dá)量最高，三得利相對(duì)表達(dá)量最小。逆境相關(guān)基因ORE1、RD29A、SAG12和SAG13的相對(duì)表達(dá)量與CK相比顯著提高，各基因表達(dá)量由高到低為RD29A＞ORE1＞SAG13＞SAG12。其中，表達(dá)量