紫花苜蓿幾丁質(zhì)酶Class I基因的克隆、序列分析及其表達(dá).pdf

1、幾丁質(zhì)酶(EC3.2.2.14,Chitinase)簡(jiǎn)稱Chi,分布廣泛,以幾丁質(zhì)作為它的天然底物。病原真菌細(xì)胞壁的主要成分之一也是幾丁質(zhì),幾丁質(zhì)酶可以通過(guò)降解病原真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì),以達(dá)到抑制真菌生長(zhǎng)的目的,且被分解后的細(xì)胞壁碎片還可以誘發(fā)寄主植物自身的抗病性增強(qiáng)。此外,有些幾丁質(zhì)酶兼有溶菌酶活性,可以通過(guò)破壞病原菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)使病原菌致死。幾丁質(zhì)酶的這些特性使它成為當(dāng)前抗病基因工程育種的研究焦點(diǎn)之一。
　　 紫花苜蓿(Med

2、icago sattiva L.)為多年生豆科牧草,以產(chǎn)量高、適口性好而聞名。然而,近年來(lái),苜蓿根腐病病害成為制約它發(fā)展的一大重要因素。本研究基于這一點(diǎn)考慮,通過(guò)向植物中導(dǎo)入外源幾丁質(zhì)酶基因,使其在植物體內(nèi)表達(dá),從而提高植物體對(duì)植物病害的抗性,已達(dá)到防治植物病害的目的,為進(jìn)一步研究將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胱匣ㄜ俎４蛳吕碚摶A(chǔ)。
　　 主要研究成果如下:
　　 1.本研究依據(jù)NCBI中已登錄的截形苜蓿(Medicago trun

3、catula)幾丁質(zhì)酶基因的一段EST序列(GenBank登錄號(hào):AF167323)設(shè)計(jì)引物,以“中苜6號(hào)”的RNA為模板,利用RACE技術(shù)進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆,分別擴(kuò)增出400bp(3’-RACE)和800bp(5’-RACE)的片段；
　　 2.利用生物信息學(xué)軟件對(duì)該序列進(jìn)行分析得知:該基因全長(zhǎng)1132bp,其中含有一個(gè)930bp的開(kāi)放閱讀框,編碼309個(gè)氨基酸。將該基因命名為MsChiⅠ(GenBank登錄號(hào):HM2244

4、49)。聚類分析顯示:它與其他已知植物ClassⅠ類幾丁質(zhì)酶基因具有高度的同源性；功能分析可知:該蛋白為親水性非跨膜蛋白,屬于幾丁質(zhì)酶第19家族；
　　 3.采用限制性內(nèi)切酶(NcoⅠ和SpeⅠ)雙酶切法,構(gòu)建了植物表達(dá)載體MsChi-pCAMBIA1302,并采用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中,用干煙草的轉(zhuǎn)化；
　　 4.通過(guò)共培養(yǎng)、篩選、再生得到轉(zhuǎn)基因煙草植株,并進(jìn)行PCR、RT-PCR的分子檢測(cè),說(shuō)明目的基因已經(jīng)