紫花苜蓿萌發(fā)期耐鹽評價(jià)與轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、世界上存在大面積的鹽堿土地，且鹽堿化面積逐年增加。土壤鹽漬化是限制影響作物生長的重要非生物脅迫因素。紫花苜蓿是重要的豆科牧草，對土壤鹽堿有一定的耐受能力。本研究的目的是通過對耐鹽品種的評價(jià)，利用高通量測序技術(shù)對紫花苜蓿進(jìn)行萌發(fā)期耐鹽的轉(zhuǎn)錄組分析。本研究分為萌發(fā)期耐鹽評價(jià)和轉(zhuǎn)錄組分析兩部分。萌發(fā)期耐鹽評價(jià)包括適宜鹽濃度篩選、耐鹽品種（系）篩選和耐鹽脅迫解除研究，轉(zhuǎn)錄組分析為有參分析。
　　1.萌發(fā)期耐鹽評價(jià)：
　　（1）適宜鹽

2、濃度篩選：以阿爾岡金為試驗(yàn)材料，設(shè)置NaCl溶液的濃度梯度為：0、100、150、200、250、300 mM。當(dāng)NaCl濃度為150 mM時(shí)，種子發(fā)芽率為29％，比對照處理下的發(fā)芽率低52%；當(dāng)NaCl濃度分別為200、250、300 mM時(shí)，種子發(fā)芽率分別為12%、9%、2%，說明種子萌發(fā)受到較嚴(yán)重的抑制。故選取150 mM用于后續(xù)試驗(yàn)研究。
　?。?）耐鹽評價(jià)：用150 mM NaCl溶液處理40個(gè)地方品種和40個(gè)國外品種，

3、相關(guān)分析表明，性狀間大部分呈極顯著正相關(guān)。根據(jù)80個(gè)品種的發(fā)芽率耐鹽系數(shù)值大小將材料分為5級，高度耐鹽（占17.5%）、耐鹽（占35.0%）、中度耐鹽（占30.0%）、敏感（占15.0%）、高度敏感（占2.5%）。選取耐鹽品種無棣苜蓿和鹽敏感品種金皇后用于下一步試驗(yàn)。
　?。?）解除鹽脅迫試驗(yàn)：用150 mM NaCl溶液處理無棣苜蓿和金皇后，取培養(yǎng)5天后未萌發(fā)種子進(jìn)行解除脅迫試驗(yàn)。解除脅迫后，無棣苜蓿和金皇后的發(fā)芽率分別增加了2

4、0%和6%。而蒸餾水中已萌發(fā)的種子，再受脅迫處理，萌發(fā)未受影響。表明萌發(fā)早期為種子萌發(fā)重要節(jié)點(diǎn)。
　　2.轉(zhuǎn)錄組分析：選取耐鹽品種無棣苜蓿和鹽敏感品種金皇后用耐鹽轉(zhuǎn)錄組分析。
　?。?）測序數(shù)據(jù)質(zhì)量匯總：從構(gòu)建的12個(gè)表達(dá)文庫中，共測序產(chǎn)出Raw data87.062 G，Clean data86.513 G。無棣苜蓿共測出145713211條reads，其中對照處理共測出71431607條reads，脅迫條件下共測出753

5、01344條reads；金皇后共測出142662828條reads，其中對照處理中共測出71569840條reads，脅迫條件下共測出71908642條reads。
　?。?）序列比對分析：使用HISAT軟件將序列數(shù)據(jù)比對到蒺藜苜蓿基因組上。對照處理下無棣苜蓿和金皇后的比對率分別為47.67%和47.73%；鹽處理下無棣苜蓿和金皇后的比對率分別為47.37%和47.37%。
　?。?）差異表達(dá)基因分析：使用StringTie

6、和Ballgown軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，篩選出25個(gè)差異表達(dá)基因和42個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。使用DESeq軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，無棣苜蓿在脅迫條件下篩選出583個(gè)差異表達(dá)基因，金皇后在脅迫條件下篩選出287個(gè)差異表達(dá)基因。
　?。?）鹽脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因的GO功能注釋：利用GO分析對100個(gè)鹽脅迫相關(guān)的DEG進(jìn)行功能歸集，在BP大類中，最具有代表性的為代謝過程、細(xì)胞進(jìn)程、單個(gè)組織進(jìn)程、生物調(diào)節(jié)、刺激反應(yīng)等。在M