轉(zhuǎn)小麥泛素基因煙草的低溫耐性的研究.pdf

1、泛素/26S蛋白酶體途徑（ubiquitin/26S proteasome pathway，UPP）是目前已知最重要的、有高度選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑。逆境脅迫下生物細(xì)胞內(nèi)無功能蛋白質(zhì)的積累增多，及時(shí)清除這些無功能蛋白質(zhì)成為生物適應(yīng)逆境的重要方式。已有研究表明，泛素基因在逆境條件下表達(dá)顯著增加，短命調(diào)節(jié)蛋白及異常蛋白降解速率加快，間接說明泛素系統(tǒng)在生物逆境適應(yīng)中的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆了小麥單體泛素基因，構(gòu)建了正義表達(dá)載體

2、，轉(zhuǎn)化煙草獲得了過量表達(dá)泛素基因的轉(zhuǎn)基因株系多個(gè)；同時(shí)克隆了煙草的泛素基因，構(gòu)建了反義表達(dá)載體，反義轉(zhuǎn)化煙草獲得了抑制煙草泛素基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系多個(gè)。研究發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)泛素提高了煙草的抗旱性、耐鹽性。本研究以正義Ta-Ub2泛素基因系（T2-2，T2-11，T2-13）、轉(zhuǎn)反義Nt-Ub1泛素基因系（AT2-1，AT2-3，AT2-10）以及轉(zhuǎn)空載體對照植株（T-GUS）為材料，低溫4℃或10℃脅迫處理1-5d，室溫恢復(fù)3d，研究過量表

3、達(dá)泛素基因?qū)D(zhuǎn)基因煙草低溫耐性的影響。從低溫脅迫下轉(zhuǎn)泛素基因煙草的外部形態(tài)變化、光合能力、滲透調(diào)節(jié)能力、膜傷害程度、活性氧積累與清除、抗氧化酶活性、泛素蛋白表達(dá)情況以及蛋白質(zhì)氧化損傷等多個(gè)方面，分析了泛素系統(tǒng)影響植物低溫性的生理生化機(jī)制。主要結(jié)果如下：
　　 （1）低溫脅迫造成煙草光合機(jī)構(gòu)受到損傷，導(dǎo)致光合速率（Pn）、PSII最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSII實(shí)際光化學(xué)效率（ФPSII）下降。相對于對照植株（野生型和轉(zhuǎn)空載

4、體煙草），過量表達(dá)Ta-Ub2泛素基因的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)n、Fv/Fm、ФPSII下降相對緩慢，表明低溫脅迫下，過量表達(dá)Ta-Ub2泛素基因的轉(zhuǎn)基因植株光合機(jī)構(gòu)的穩(wěn)定性維持較好，特別是減輕了低溫對PSII的光抑制。
　　 （2）低溫脅迫引起細(xì)胞脫水。過量表達(dá)泛素基因使轉(zhuǎn)基因株系中脯氨酸、可溶性糖的積累多，滲透調(diào)節(jié)能力較強(qiáng)，有效的防止了細(xì)胞的低溫脫水現(xiàn)象。抑制泛素基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸、可溶性糖的積累量少，滲透調(diào)節(jié)低，水分狀況維

5、持較差。
　　 （3）低溫脅迫引起生物膜損傷，導(dǎo)致膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA)含量和膜透性增加。過量表達(dá)泛素基因的轉(zhuǎn)基因株系，細(xì)胞膜受低溫傷害的程度較輕，表現(xiàn)為MDA含量及電解質(zhì)外滲量較低，有效保護(hù)了生物膜的穩(wěn)定性和完整性；相反，抑制泛素基因表達(dá)導(dǎo)致低溫脅迫下生物膜的損傷更為嚴(yán)重。
　　 （4）低溫脅迫導(dǎo)致超氧陰離子自由基（O2?-)生成速率和過氧化氫（H2O2)積累增多。過量表達(dá)泛素基因的轉(zhuǎn)基因株系中，主要抗氧化酶（

6、SOD，CAT，POD，APX)的活性相對較高，超氧陰離子生成速率和過氧化氫積累較少。抑制泛素基因表達(dá)則加劇轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)超氧陰離子和過氧化氫的積累。
　　 （5）對煙草泛素蛋白進(jìn)行免疫印跡雜交發(fā)現(xiàn)，無論在正常生長條件還低溫處理?xiàng)l件下，過量表達(dá)泛素基因轉(zhuǎn)基因株系與野生型植株的泛素單體蛋白水平?jīng)]有顯著差異，但過量表達(dá)泛素基因植株的結(jié)合態(tài)泛素積累明顯高于野生型植株。
　　 （6）低溫脅迫導(dǎo)致了煙草葉片細(xì)胞蛋白質(zhì)的氧化損傷，而

7、蛋白質(zhì)羰基化是不可逆的過程，是蛋白質(zhì)氧化的主要產(chǎn)物。對過量表達(dá)泛素基因的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡雜交，分析羰基化蛋白質(zhì)含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫處理后過量表達(dá)泛素基因的轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)羰基化程度明顯的比對照植株輕，表明過量表達(dá)泛素基因在一定程度上減輕了低溫對蛋白質(zhì)氧化損傷。
　　 綜上所述，過量表達(dá)泛素單體提高了轉(zhuǎn)基因煙草植株對低溫脅迫的適應(yīng)能力，抑制泛素基因的表達(dá)則降低了轉(zhuǎn)基因植株耐低溫能力。說明泛素系統(tǒng)與植物的低溫耐性關(guān)系密切，