雪蓮磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白基因表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、不良環(huán)境是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的非常重要的非生物脅迫因素，在各種非生物脅迫中，低溫對植物的影響最為突出。如何通過各種有效途徑提高農(nóng)作物的抗寒性，減輕低溫冷害對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失，是生命科學(xué)領(lǐng)域面臨的一個重要研究課題。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用導(dǎo)入抗寒相關(guān)基因并使其表達(dá)，依靠其產(chǎn)物直接提高植物抗寒性，成為目前有效改善植物抗寒性的重要途徑。研究表明膜脂中磷脂含量與抗寒性密切相關(guān)(如磷脂酰乙醇胺)，而膜蛋白同樣是調(diào)節(jié)膜冷穩(wěn)定性的重要因

2、素。經(jīng)序列比對，雪蓮磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-bindingfamilyprotein簡稱PBP)基因(XLPBP)與擬南芥磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白基因(已證實其表達(dá)產(chǎn)物有抗寒功能)有80％以上同源性。因此XLPBP可能屬抗寒相關(guān)基因，其表達(dá)產(chǎn)物有可能與細(xì)胞膜的冷穩(wěn)定性有關(guān)，從而在植物抗寒能力方面起一定作用。 本研究根據(jù)植物表達(dá)載體的構(gòu)建策略，首次成功構(gòu)建了含雪蓮PBP基因的植物高效雙元

3、表達(dá)載體pXLPBP，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對不同品種陸地棉進行了遺傳轉(zhuǎn)化，初步建立了陸地棉再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了GUS基因檢測陽性的棉花愈傷組織，利用花粉管通道法對不同品種陸地棉進行遺傳轉(zhuǎn)化并收獲了種子。主要研究結(jié)果如下： 1構(gòu)建了植物表達(dá)載體pXLPBP 將XLPBP全長基因克隆到pGEM-Teasy載體上，酶切后得到XLPBP目的基因片段，純化回收，克隆到pCAMBIA3301載體中，構(gòu)建成攜帶有非編碼序列的X

4、LPBP全長基因片段、CaMV35S啟動子和GUS報告基因的高效雙元植物表達(dá)載體pXLPBP。 2初步建立了陸地棉遺傳轉(zhuǎn)化體系 (1)以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別對不同品種陸地棉進行遺傳轉(zhuǎn)化，篩選到了莖尖生長最適培養(yǎng)基和莖段愈傷組織生長最適培養(yǎng)基，研究了預(yù)培養(yǎng)時間、菌液濃度及感菌時間等因素對轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物的影響，發(fā)現(xiàn)將培養(yǎng)5d的不同品種陸地棉莖尖和莖段在OD600=0.4的農(nóng)桿菌菌液中浸泡10min后，在含有2,4-D0.1mg/L、

5、KT0.1mg/L、pH5.8的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上22℃暗培2d，遺傳轉(zhuǎn)化效率最高。 (2)研究了棉花莖尖、莖段外植體對卡那霉素的敏感性，確定了抗生素的最佳選擇壓力，即卡那霉素50mg/L，最適的抑菌劑為頭孢霉素500mg/L。 3獲得了GUS基因檢測陽性的棉花愈傷組織 通過抗生素的篩選，將所得到的抗卡那霉素愈傷組織進行GUS檢測，結(jié)果顯示藍(lán)色，初步證明目的基因已整合到棉花基因組中。 4用花粉管通道法對陸地棉進