雙表達(dá)HBV-S DNA疫苗免疫效果研究.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個世界性的公共衛(wèi)生問題。目前最有效的預(yù)防和控制乙型肝炎病毒感染的措施就是接種乙型肝炎疫苗。常規(guī)使用的乙型肝炎疫苗，由于免疫原性弱，在制備時加入鋁劑，雖然體液免疫應(yīng)答得到加強(qiáng)，但鋁劑抑制機(jī)體的細(xì)胞免疫，因而常規(guī)疫苗接種后只能產(chǎn)生較好的預(yù)防作用，基本不具備治療功效。而且，常規(guī)疫苗即使按照0、1、6月程序?qū)】嫡哌M(jìn)行全程免疫后，仍然有5％一lO％的接種者血清抗-HBs始終陰性或達(dá)不到保護(hù)閾值，成為乙型肝炎病

2、毒的易感者。HBV-SDNA疫苗兼具預(yù)防和治療作用，但因其引發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答弱，目前還不能應(yīng)用于臨床。本實(shí)驗(yàn)為增強(qiáng)HBV-SDNA疫苗的免疫應(yīng)答效果，進(jìn)一步探索HBV-SDNA疫苗在預(yù)防和治療慢性乙型肝炎領(lǐng)域的可行性。 方法：PCR擴(kuò)增目的基因片段S1和S2，分別T-A克隆到pMDl8-TS載體中，構(gòu)建pMDl8-TS-S1和pMDl8-TS-S2并測序。將pMDl8-TS-S1中目的基因片斷S1定向克隆到質(zhì)粒pVITR03-M

3、CS中，構(gòu)建pVITR03一S1；將pMDl8-TS-S2中目的基因片斷S2定向克隆到質(zhì)粒pVITR03-MCS中，構(gòu)建pVITR03一S2；再將pMDl8-TS-S2中目的基因片斷S2定向克隆到質(zhì)粒pVITR03一S1中，構(gòu)建pVITR03．S1S2。用脂質(zhì)體將對照質(zhì)粒pVITR03-mcs、表達(dá)質(zhì)粒pVITR03一Sl、pVITR03一S2和pVITR03一S1S2分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，以潮霉素篩選獲得抗性克隆，檢測細(xì)胞上清液HB

4、sAg表達(dá)。將對照質(zhì)粒pVITR03-mcs、表達(dá)質(zhì)粒pVITR03一S1、pVITR03一S2和pVITR03一S1S2分別免疫接種BALB／C小鼠，檢測小鼠血清中的抗-HBs。 結(jié)果：通過限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定和核酸序列分析鑒定，我們成功構(gòu)建了質(zhì)粒pMDl8-TS—S1、pMDl8-TS-S2和表達(dá)質(zhì)粒pVITR03．S1、pVITR03一S2以及pVITR03一S1S2。體外實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pVITR03-mcs的He

5、pG2細(xì)胞在第24h、48h和72h細(xì)胞上清液HBsAgS／N值分別為：1．75±0．06，1．82±O．10，1．79±O．12；轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒pVITR03一S1的HepG2細(xì)胞在第24h、48h和72h細(xì)胞上清液HBsAgS／N值分別為：3．98±0．56，9．06±0．95，10．28±0．36；轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒pVITR03一S2的HepG2細(xì)胞在第24h、48h和72h細(xì)胞上清液HBsAgS／N值為：4．02±0．26，9．60±

6、0．51，¨．07±0．52；轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒pVITR03．S1S2的HepG2細(xì)胞在第24h、48h和72h細(xì)胞上清液HBsAgS／N值為：7．67±0．50，16．78±0．52，18．19±1．03。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，接種質(zhì)粒pVITR03-mcs的小鼠血清抗-HBs陽轉(zhuǎn)率為O；接種表達(dá)質(zhì)粒pVITR03一S1的小鼠血清抗-HBs陽轉(zhuǎn)率為50％；接種表達(dá)質(zhì)粒pVITR03．S2的小鼠血清抗-HBs陽轉(zhuǎn)率為58．3％；接種表達(dá)質(zhì)粒pV

7、ITR03．S1S2的小鼠血清抗-HBs陽轉(zhuǎn)率833％。同時，在抗-HBs陽轉(zhuǎn)小鼠中，接種表達(dá)質(zhì)粒pVITR03一S1的小鼠血清抗-HBs濃度為15．78±3~89mIU／ml；接種表達(dá)質(zhì)粒pVITR03一S2的小鼠血清抗-HBs濃度為16．32±4．76mIU／ml；接種表達(dá)質(zhì)粒pVITR03一S1S2的小鼠血清抗-HBs濃度為23．81±8．11mIU／ml。 結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pVITR03-mcs的HepG2細(xì)

8、胞不能表達(dá)HBsAg；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pVITR03一Sl、pVITR03一S2和pVITR03一S1S2的HepG2細(xì)胞能表達(dá)HBsAg，但轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒pVITR03一S1S2的HepG2細(xì)胞HBsAg表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒pVITR03一S1和pVITR03一S2的HepG2細(xì)胞的表達(dá)量。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，接種質(zhì)粒pVITR03-mcs的小鼠不能產(chǎn)生具有保護(hù)性濃度的抗-HBs；接種表達(dá)質(zhì)粒pVITR03一S1、pVITR03一S2和pVIT