大腸桿菌雙順反子表達(dá)載體中各基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平的研究.pdf

1、從20世紀(jì)70年代初期基因克隆技術(shù)建立至今，短短幾十年的時(shí)間，基因克隆技術(shù)發(fā)展十分迅猛，迄今已有很多外源基因被克隆到不同的表達(dá)載體中，進(jìn)行各種研究，以期造福人類。構(gòu)建多順反子表達(dá)載體，研究原核生物多順反子不同間隔區(qū)對外源基因表達(dá)效率的影響，將對多基因共表達(dá)具有一定的指導(dǎo)意義。
　　 本研究從大腸桿菌基因組序列出發(fā)，對其多順反子間隔區(qū)多種形式和序列進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)室已有以報(bào)告基因--β-半乳糖苷酶(GAL)和綠色熒光蛋白(GFP)基

2、因組成的雙順反子表達(dá)載體pET28a-lacZ-gfpD(無間隔序列)，pET28a-lacZgfpL(間隔序列為起始密碼子與終止密碼子重迭序列)，pET28a-lacZ-gfpR(β-半乳糖苷酶與綠色熒光蛋白融合表達(dá))，pET28a-lacZ-gfg15(間隔序列為pET-32a中T7啟動(dòng)子后的核糖體結(jié)合序列)及pET28a-lacZ-gfp51(間隔序列為lacZ和lacY之間天然間隔區(qū))，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建雙順反子表達(dá)載體pE

3、T28a-lacZ'-gfpL(lacZ加入RBS序列)和pET28a-lacZ'(lacZ加入RBS序列)。將上述質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)室保存的對照質(zhì)粒pET28a-gfp、pET28a-lacZ和pET28a轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Tuner(DE3)中，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別以GFP的熒光強(qiáng)度衡量GFP的表達(dá)水平，以GAL的酶活力衡量GAL的表達(dá)水平，最終用蛋白質(zhì)電泳進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，雙順反子表達(dá)載體中不同的間隔序列不僅對位于下游的順反子gf