表達(dá)H5B1血凝素HA1重組乳酸菌的構(gòu)建及其免疫效力的研究.pdf

1、為研制安全、有效、方便操作的口服免疫禽流感活載體疫苗，本試驗(yàn)從健康成年雞回盲腸黏膜處分離篩選到一株具有較強(qiáng)耐酸能力及較好上皮細(xì)胞粘附能力的雞源乳桿菌DLD17。通過分子生物學(xué)的方法，我們構(gòu)建了重組H5N1血凝素乳酸乳球菌表達(dá)質(zhì)粒pMG36EH和重組H5N1血凝素乳酸乳桿菌表達(dá)質(zhì)粒pLEM415-pH，通過電擊轉(zhuǎn)化分離的雞源乳酸菌DLD17，乳酸乳球菌1363和嗜酸乳桿菌4356。我們獲得了穩(wěn)定表達(dá)禽流感血凝素蛋白的三株重組乳酸菌，即重組

2、乳酸乳球菌LL36EH、重組雞源乳桿菌DLD17-pH和重組嗜酸乳桿菌4356-pH。首先將三株重組乳酸菌口服免疫小鼠，及其產(chǎn)生的免疫效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)和比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組雞源乳桿菌DLD17-pH在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫、細(xì)胞免疫的效果最好。因此我們選用重組雞源乳桿菌DLD17-pH口服免疫雛雞并對(duì)其免疫效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果證實(shí)，重組雞源乳桿菌DLD17-pH能夠在雛雞的盲腸內(nèi)定植并穩(wěn)定繁殖。它不但較早、較快的誘導(dǎo)呼吸道、消化道黏膜禽流感

3、特異性IgA抗體的產(chǎn)生，而且也能在一定程度上誘導(dǎo)全身性禽流感特異性IgG抗體的分泌。除此之外，重組雞源乳桿菌DLD17-pH還能激活機(jī)體細(xì)胞免疫和先天性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫防御能力。因此，重組雞源乳桿菌DLD17-pH口服疫苗的研制，為預(yù)防和控制禽流感的傳播提供了新的研究思路，為宿主乳酸菌作為活載體遞送表達(dá)系統(tǒng)理論研究和實(shí)踐應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。具體分為以下四個(gè)方面:
　　 1.雞源乳酸菌的分離、鑒定與篩選
　　 首先從健康

4、成年雞盲腸黏膜處分離了22株革蘭氏陽(yáng)性菌株，設(shè)計(jì)細(xì)菌16s-rRNA細(xì)菌特異性引物，擴(kuò)增每株細(xì)菌的16s片段，并與菌株信息庫(kù)比對(duì)確定菌株的種屬。再次篩選從而確定了5株雞源乳酸菌（DLD-1、DLD-5、DLD-9、DLD-13、DLD-17）用作受體轉(zhuǎn)化菌株備用。同時(shí)結(jié)合菌株生化發(fā)酵試驗(yàn)，鑒定了五株雞源乳酸菌的屬種。此外，我們還對(duì)五株雞源乳桿菌的耐酸性、對(duì)Caco-2細(xì)胞粘附力以及抗生素敏感性進(jìn)行測(cè)定。通過乳酸乳球菌1363和嗜酸乳桿菌

5、4356作為電擊轉(zhuǎn)化陽(yáng)性對(duì)照受體菌株，以乳酸乳球菌質(zhì)粒pMG36E和乳酸桿菌質(zhì)粒pLEM415為空載體質(zhì)粒，進(jìn)行感受態(tài)的制備和電轉(zhuǎn)條件的摸索，確定了乳酸菌株轉(zhuǎn)化的最優(yōu)電擊轉(zhuǎn)化方案。獲得最優(yōu)轉(zhuǎn)化方案后，對(duì)五株雞源乳桿菌做電擊轉(zhuǎn)化篩選試驗(yàn)，篩選能夠接受外源質(zhì)粒的雞源乳桿菌。試驗(yàn)結(jié)果證明，我們分離并篩選到的五株菌株中，一株為糞腸乳球菌DLD-1，一株為發(fā)酵乳酸桿菌（DLD-5），三株為唾液乳酸桿菌(分別為DLD-9、DLD-13、DLD-17

6、)。通過電擊轉(zhuǎn)化篩選試驗(yàn)，我們得到一株雞源乳桿菌適合接受外源性質(zhì)粒，即唾液乳酸桿菌DLD17。
　　 2.表達(dá)H5N1血凝素重組乳酸菌的構(gòu)建及其驗(yàn)證
　　 我們首先設(shè)計(jì)含有限制性內(nèi)切酶SalⅠ和HindⅢ的禽流感血凝素特異性上下游引物HAF1和HAF2，PCR擴(kuò)增H5N1亞型高致病性禽流感(AIV)血凝素部分片段HA1，連接pMD19T載體，測(cè)序驗(yàn)證后，用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和HindⅢ分步酶切表達(dá)質(zhì)粒pMG36E和克隆

7、質(zhì)粒pMD19T-H，回收并連接載體骨架pMG36E與目的片段HA1，連接獲得了乳酸乳球菌表達(dá)質(zhì)粒pMG36E-H;通過電擊轉(zhuǎn)化的方法，獲得重組乳酸乳球菌1363-EH（即含pMG36E-H），經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢驗(yàn);結(jié)果表明，43KDa的血凝素蛋白在乳酸乳球菌內(nèi)正確表達(dá)。同以上方法，我們也構(gòu)建了重組血凝素乳酸桿菌的表達(dá)質(zhì)粒pLEM415-pH。我們?cè)O(shè)計(jì)啟動(dòng)子引物P1和P2，擴(kuò)增乳酸菌的乳酸脫氫酶(LDH)啟動(dòng)

8、子P;血凝素引物HAF1和HAF2擴(kuò)增乳桿菌血凝素片段HA1，通過分子生物學(xué)酶切連接的方案，將啟動(dòng)子P和血凝素基因HA1依次連接到乳桿菌空載體表達(dá)質(zhì)粒pLEM415上，從而獲得了重組乳酸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pLEM415-pH。然后通過電擊轉(zhuǎn)化的方法，轉(zhuǎn)入到雞源乳桿菌DLD17和嗜酸乳桿菌4356菌株內(nèi)，獲得兩株重組血凝素基因的乳酸桿菌，分別是重組雞源乳桿菌DLD17-pH和重組嗜酸乳桿菌4356-pH。通過蛋白電泳和Western-blot驗(yàn)

9、證，結(jié)果表明，血凝素HA1可以在兩株重組乳酸桿菌中表達(dá)?？傊?，我們獲得了三株表達(dá)禽流感血凝素的重組乳酸菌，分別為重組乳酸乳球菌LL36EH、重組雞源乳桿菌DLD17-pH和重組嗜酸乳桿菌4356-pH，為下面表達(dá)禽流感血凝素重組乳酸菌口服疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 3.三株重組乳酸菌口服免疫小鼠及其免疫效果的研究
　　 運(yùn)用第二章轉(zhuǎn)化獲得的三株重組乳酸菌(1363-EH、DLD7-pH、LA4356-pH)口服免疫小鼠，

10、研究小鼠呼吸道、消化道局部和全身免疫抗體水平的變化;以及分離免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，分析CD4+/CD8+、CD19+細(xì)胞亞群的變化;并在體外用血凝素HA1抗原特異性刺激來研究脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的分泌情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1363-EH、4356-pH、D(1)D7-pH三株重組乳酸菌口服免疫小鼠，免疫后1周，其均可顯著誘導(dǎo)腸道禽流感特異性IgA抗體的分泌;隨著時(shí)間的加長(zhǎng)，LL36EH、4356-pH兩株免疫小鼠組

11、的特異IgA抗體水平下降，而DLD-pH株免疫產(chǎn)生的禽流感抗體表達(dá)隨時(shí)間增加處于穩(wěn)定水平。由此可見，三株乳酸菌均能誘導(dǎo)局部黏膜免疫應(yīng)答。而在氣管內(nèi)，僅有雞源乳桿菌DLD17-pH免疫組誘導(dǎo)了特異性IgA的顯著性分泌，其出現(xiàn)的時(shí)間比腸道晚一周。在全身性免疫反應(yīng)的檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)三株重組乳酸菌免疫后小鼠，血清內(nèi)特異性IgG抗體和HI效價(jià)都較低，其中DLD17-pH免疫組小鼠抗體滴度最高為4.5(Log2)。小鼠脾臟淋巴細(xì)胞激增殖試驗(yàn)和CD4

12、+/CD8+、CD19+細(xì)胞亞群細(xì)胞的變化表明重組乳酸菌可在體內(nèi)激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞;其中致敏的T淋巴細(xì)胞，主要以Th2型輔助性T細(xì)胞的增殖有關(guān)，而三株之間沒有顯著差異。由以上結(jié)果可知，三株表禽流感血凝素的重組乳酸菌，口服免疫小鼠后，在一定程度上均可刺激機(jī)體發(fā)生禽流感特異性體液、細(xì)胞免疫反應(yīng);但因菌株來源、特性的不同，免疫效果差別較大。重組雞源乳桿菌DLD17-pH在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫、細(xì)胞免疫的效果最好，尤其可以有效誘導(dǎo)腸道、

13、呼吸道黏膜特異性IgA抗體的分泌，更適合應(yīng)用于家禽禽流感的黏膜免疫。
　　 4.重組雞源乳桿菌DLD17-pH口服免疫雛雞效果的研究
　　 運(yùn)用第三章篩選的優(yōu)良重組雞源乳桿菌DLD17-pH口服免疫雛雞，研究雛雞呼吸道、消化道局部和全身免疫抗體水平的變化，并對(duì)重組雞源乳桿菌DLD17-pH在雛雞腸道內(nèi)的定植情況進(jìn)行檢測(cè);同時(shí)與禽流感滅活疫苗的免疫效果進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn):口服重組雞源乳桿菌DLD17-pH，不但能誘導(dǎo)空腸、

14、盲腸黏膜局部特異性IgA的產(chǎn)生，還能夠誘導(dǎo)氣管處黏膜特異性IgA的產(chǎn)生。此外，口服重組雞源乳桿菌也能夠誘導(dǎo)全身特異性IgG抗體的產(chǎn)生，但是水平較低。與皮下免疫禽流感滅活疫苗組相比，重組雞源乳桿菌的口服免疫24h后，能顯著上調(diào)消化道、呼吸道局部組織處的細(xì)胞因子IFN-γ、模式識(shí)別受體TLR-2、防御素AvBD-9的基因表達(dá);而下調(diào)細(xì)胞因子IL-4基因的表達(dá)。盲腸內(nèi)重組雞源乳桿菌DLD17-pH數(shù)量的檢測(cè)表明，口服免疫后，重組雞源乳桿菌DL