毛頭鬼傘菌絲體多糖的分離、純化和化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性研究.pdf

1、毛頭鬼傘[Coprinus comatus(Mueller.ex Fr.)S.F.Grayl]，俗稱雞腿菇、雞腿蘑，是一種食、藥用真菌，其肉質(zhì)細(xì)嫩，鮮美可口，色香味俱全。藥用味甘滑，性平，有益脾胃，清心安神，治痔等功效。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，毛頭鬼傘主要具有降血糖、降血脂、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抑菌等作用。目前關(guān)于毛頭鬼傘的研究，大多集中在其栽培技術(shù)和營(yíng)養(yǎng)成分方向的研究，而對(duì)于毛頭鬼傘多糖的提取、分離純化和組成，以及生物活性作用探討等方面還報(bào)道不多，

2、特別是均一多糖的結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性研究還未見(jiàn)報(bào)道；同時(shí)，獲得食藥用菌多糖的途徑有兩種，一種是從子實(shí)體中提取，一種是從發(fā)酵產(chǎn)物中獲取。采用深層發(fā)酵培養(yǎng)毛頭鬼傘菌絲體，生產(chǎn)周期縮短，且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，材料易得，生產(chǎn)成本大幅下降，因此利用液態(tài)深層發(fā)酵是開(kāi)發(fā)毛頭鬼傘活性成分的一條有效途徑。為了系統(tǒng)的研究毛頭鬼傘菌絲體多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，本研究對(duì)毛頭鬼傘菌絲體進(jìn)行了深層發(fā)酵，并對(duì)其菌絲體多糖進(jìn)行了提取、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和免疫活性研究。

3、 本論文共有四個(gè)部分，分別從菌絲體的深層發(fā)酵、多糖分離、純化和理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)鑒定和免疫活性進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下： 1、毛頭鬼傘菌絲體的深層發(fā)酵研究本章比較了毛頭鬼傘正常(CN)菌絲體和太空種(CS)菌絲體的生長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)代謝曲線，CN菌絲體生長(zhǎng)勢(shì)、多糖總量和生物量均優(yōu)于CS菌絲體，它們的生長(zhǎng)代謝曲線基本相似，因此，選擇CN進(jìn)行全面的研究。 在3 L發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn)速在120～180rpm，通氣量在1.2～2.4 L/mi

4、n范圍內(nèi)，以菌絲體生物量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為指標(biāo)時(shí)，轉(zhuǎn)速為180rpm，通氣量為2.4L/min是最優(yōu)的轉(zhuǎn)速和通氣量。在30L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為：26℃，工作體積為2/3，10％的接種量，在O～24h中，轉(zhuǎn)速為150rpm，通氣量為10L/min；在24～96h中，轉(zhuǎn)速為200rpm，通氣量為20L/min，發(fā)酵4天。發(fā)酵5個(gè)批次，菌絲體生物量最高達(dá)17.26g/L。 2、毛頭鬼傘菌絲體多糖分離純化和理化性質(zhì)研究毛頭鬼傘菌絲體經(jīng)9

5、5％乙醇脫脂后，依次經(jīng)過(guò)沸水、堿液提取，得到水提粗多糖C30、C60、C80、C80s和堿提水溶性多糖CAP五個(gè)組分。毛頭鬼傘菌絲體水提多糖的總得率(包括C30、C60和C80)為15.6％，要比子實(shí)體(6.5％)高2.4倍。通過(guò)單糖組成分析結(jié)果表明，毛頭鬼傘菌絲體多糖主要由Glc、Gal、Fuc組成。C30、C60、C80組分經(jīng)離子柱(DEAE-Sepharose Fast Flow)和凝膠柱(Sephacryl S100～500填料

6、)層析分離純化，共得到14個(gè)多糖，通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)為均一多糖。 3、毛頭鬼傘菌絲體三種均一多糖的結(jié)構(gòu)鑒定通過(guò)糖組成分析、甲基化分析、IR和NMR譜(一維：<'1>H NMR譜，<'13>C NMR譜，二維：COSY譜，TOCSY譜，HMQC譜，HMBC譜和NOESY譜)等方法，研究了其中3種均一多糖C30-FA3、C60-FA1和C60-FB1的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 ①C30-FA3的結(jié)構(gòu)分析均一多糖C30-FA3的分子量為1

7、.03×10<'4>Da，糖組成為Fue∶Gal=1∶4.02。C30-FA3甲基化分析結(jié)果表明，巖藻糖以端基方式連接，半乳糖主要以1,6-和1，2，6-兩種方式連接，三個(gè)主要的連接方式的摩爾比為1.15∶2.88∶1。由NMR進(jìn)一步分析結(jié)果表明，C30-FA3主要由(1，6)-α-D-Galp糖殘基構(gòu)成主鏈，在O-2位被α-L-Fucp糖殘基取代的五個(gè)單糖殘基組成的結(jié)構(gòu)重復(fù)單元。 ②C60-FA1的結(jié)構(gòu)分析均一多糖C60-FA

8、1的分子量為1.03×10<'4>Da，糖組成為Fuc∶Gal∶Glc=1∶3.04∶0.53。C60-FA1甲基化分析結(jié)果表明，巖藻糖以端基方式連接，半乳糖主要以1,6-和1，2，6-兩種方式連接，三個(gè)主要的連接方式的摩爾比為1∶2.04∶0.91，含有少量1，4-和1,6-連接方式的葡萄糖。由NMR進(jìn)一步分析結(jié)果表明，C60-FA1主要由(1，6)-α-D-Galp糖殘基構(gòu)成主鏈，在O-2位被α-L-Fucp糖殘基取代的四個(gè)單糖殘基

9、組成的結(jié)構(gòu)重復(fù)單元。 ③C60-FB1的結(jié)構(gòu)分析@2 均一多糖C60-FB1的分子量為16.69×10<'4> Da，糖組成為Glc，是非淀粉類新葡聚糖。C60-FB1甲基化分析結(jié)果表明，葡萄糖以1，4-方式連接，少量葡萄糖以端基方式連接。C60-FB1的主要結(jié)構(gòu)重復(fù)單元為： 4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→可能以自由卷曲結(jié)構(gòu)存在。 4、毛頭鬼傘菌絲體多糖的體外免疫活性研究對(duì)分離純化過(guò)程中的各

10、多糖組分和最終獲得的均一多糖進(jìn)行體外免疫活性試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C30、C60、C80三種粗多糖對(duì)淋巴細(xì)胞均有刺激淋巴細(xì)胞增殖作用，且三者的增殖作用相當(dāng)，對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖率依次遞減；C80s、CAP對(duì)淋巴細(xì)胞無(wú)增殖作用或增殖作用不大。粗多糖C30、C60、C80經(jīng)離子柱分離后，鹽相各組分對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖作用均要高于水相部分。經(jīng)多步凝膠柱純化最終得到的均一多糖中C30-FB1、C30-FB2、C60-FB2、C60-FB3、C80-FA2、C8