桑黃菌絲體和子實(shí)體中活性多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)特征研究.pdf

1、桑黃是一種多年生、黃褐色的珍稀藥用真菌，隸屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycota）、層菌綱（Hymenomycetes），非褶菌目（Aphyllophorales），銹革孔菌科（Hymenochaetaceae），針層孔菌屬（Phellinus）。研究報(bào)道，桑黃多糖是桑黃的主要生物活性物質(zhì)，具有明顯的降血糖、抗氧化、護(hù)肝、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用。桑黃多糖可以從子實(shí)體獲得也能從發(fā)酵菌絲體中獲得，子實(shí)體和液體發(fā)酵菌絲體多糖已有報(bào)道但固體發(fā)酵

2、菌絲體還少有報(bào)道，同時從不同培養(yǎng)方式獲得的桑黃多糖其理化特征及活性有何差異還沒有研究。本論文針對篩選的桑黃同一菌株子實(shí)體栽培、固體發(fā)酵和液體發(fā)酵培養(yǎng)提取的桑黃多糖的結(jié)構(gòu)特征及生物活性進(jìn)行研究比較。并對其活性多糖進(jìn)行分離純化，對分離得到的均一多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，比較不同培養(yǎng)方式對桑黃多糖結(jié)構(gòu)特征及生物活性的影響，探索桑黃菌絲體替代子實(shí)體開發(fā)利用的可行性。本論文分為五個部分，主要研究結(jié)果如下：
　　1、不同來源桑黃菌株親緣關(guān)系的分析及多

3、糖高產(chǎn)桑黃菌株的篩選
　　對收集的國內(nèi)外10個桑黃菌株進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，采用拮抗實(shí)驗(yàn)及ITS序列分析對所收集的桑黃菌株進(jìn)行鑒定和分析。構(gòu)建基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，聚成7個Group。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GroupⅠ中的SH1、SH2、SHA、SHD及W菌株歸屬為I. sanghuang；GroupⅡ中的菌株P(guān)I和SHC為I. vaninii；GroupⅤ中的PL和GroupⅥ中的SH菌株應(yīng)歸屬為I. baumii。菌株H則自成一組，其

4、與上述菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　對10個菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，比較了10個桑黃菌株的菌絲生物量、胞內(nèi)多糖及胞外多糖產(chǎn)量。可以發(fā)現(xiàn)I. sanghuang菌屬的SH1的菌絲體生物量、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量和胞外多糖產(chǎn)量均高于其他菌株。SH1的胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到59.5 mg/100 mL，胞外多糖產(chǎn)量為1.475 g/L。所以選取I. sanghuang菌屬的SH1分別進(jìn)行子實(shí)體栽培、液體發(fā)酵和固體發(fā)酵培養(yǎng)；培養(yǎng)后對其多糖含量進(jìn)行分析表明，菌絲

5、體多糖含量最高為4.06％，其次是子實(shí)體多糖含量3.51%，固體發(fā)酵產(chǎn)物的多糖含量較低，只有1.98%。
　　2、桑黃子實(shí)體和液體、固體發(fā)酵菌絲體中粗多糖組分的制備，多糖理化性質(zhì)及生物活性的比較
　　采用水提乙醇分級沉淀的方法制備了3種培養(yǎng)方式得到的桑黃子實(shí)體和菌絲體粗多糖樣品，根據(jù)乙醇沉淀濃度分別命名為FP30，F(xiàn)P50，F(xiàn)P70（子實(shí)體栽培多糖）；LP30，LP50，LP70（液體發(fā)酵菌絲體多糖）和SP30，SP50，S

6、P70（固體發(fā)酵菌絲體多糖）。分析發(fā)現(xiàn)桑黃液體發(fā)酵菌絲體的多糖得率、多糖及蛋白質(zhì)的含量均高于子實(shí)體以及固體發(fā)酵菌絲體。從工業(yè)化生產(chǎn)的角度來說，液體發(fā)酵有利于提高桑黃多糖的產(chǎn)量。固體發(fā)酵的多糖得率偏低，且多糖含量低于子實(shí)體及液體發(fā)酵菌絲體，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
　　子實(shí)體和液體發(fā)酵菌絲體中，30%醇沉組分（FP30和LP30）單糖組成均是以葡萄糖為主，而固體發(fā)酵的這一組分（SP30）5種單糖比例接近，其結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜；子實(shí)體50%醇沉組

7、分（FP50）半乳糖和甘露糖的比例增大，與葡萄糖接近1:1:2；液體發(fā)酵的這一組分中半乳糖仍不高，甘露糖的比例增加，與葡萄糖比例接近1:3；固體發(fā)酵的這一組分結(jié)構(gòu)仍很復(fù)雜，有6種單糖存在，且比例接近；70的組分的多糖樣品中，子實(shí)體和固體發(fā)酵菌絲體的多糖中阿拉伯糖和木糖的比例大大增加。
　　不同培養(yǎng)方式得到的桑黃多糖分子量差別很大，液體發(fā)酵的桑黃菌絲體多糖分子量最大為2.106×106 Da，固體發(fā)酵的菌絲體多糖分子量最大為2.92

8、6×105 Da，其余主要集中在兩萬和三萬之間，子實(shí)體多糖的分子量分布差異比較明顯，從1.989×104 Da到1.895×106 Da之間不等。
　　液體發(fā)酵的菌絲體多糖具有很好的生物活性，這為菌絲體替代子實(shí)體在一定程度上提供了理論依據(jù)。固體發(fā)酵的菌絲體多糖SP50具有很好的體外免疫活性，但SP30和SP70的活性略差，由于固體發(fā)酵的菌絲體多糖結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，影響其深度的開發(fā)利用，因此桑黃液體發(fā)酵菌絲體替代子實(shí)體開發(fā)更有前景。

9、r>　　3、三種培養(yǎng)方式的桑黃多糖的分離純化
　　采用柱層析的方法從不同培養(yǎng)方法得到的桑黃多糖中分離出5種均一的活性多糖：子實(shí)體中分離得到 FP50Y1和FP70Y2P2，分子量分別為2.01×104 Da和1.263×104 Da；液體發(fā)酵菌絲體中得到LP50P，分子量為1.956×105 Da；固體發(fā)酵菌絲體中得到SP50Y和SP70Y，SP50 Y分子量為3.615×104 Da，SP70Y的分子量1.640×104 Da。

10、
　　4、不同培養(yǎng)方式的桑黃多糖分離得到的均一多糖的結(jié)構(gòu)特征比較
　　子實(shí)體中分離得到的均一多糖FP50Y1，由3種單糖構(gòu)成，分別是巖藻糖、D-半乳糖及葡萄糖，摩爾比為1:3:6。FP50Y1的重復(fù)單元為：
　　子實(shí)體分離得到的均一多糖FP70Y2P2，主鏈由葡萄糖以1,3連接和1,6連接構(gòu)成，是一種葡聚糖。單糖組成為半乳糖、葡萄糖和甘露糖，且摩爾比為1:22:1。FP70Y2P2的重復(fù)單元為：
　　液體發(fā)酵的菌