桑黃多糖提取純化及活性研究.pdf

1、桑黃是已知生物抗癌領域功效顯著的大型真菌之一,由于過度開采,桑黃野生資源匱乏,人工栽培技術尚不成熟,使其成為研究和開發(fā)熱點。桑黃主要功效成分是多糖,多存在于子實體中,菌絲體中也有一定含量。目前關于桑黃的文獻報道主要集中在多糖提取、抗癌機理及分子結構研究。但桑黃人工栽培還處于實驗室階段,對于多糖抗癌活性的具體物質組成仍在研究中,有關不同菌種桑黃多糖的差異性研究尚不清楚。本文選用日本桑黃和韓國桑黃兩個菌種,采用袋料栽培與液體菌絲發(fā)酵法培養(yǎng)子

2、實體與菌絲體,通過單因素和正交試驗優(yōu)化提取和檢測方法,并采用離子交換柱層析法純化其多糖成分,在此基礎上進行肝癌HepG-2細胞體外抑瘤試驗,以探討不同菌種不同純度桑黃多糖的含糖量與抗癌活性差異。
　　 以棉籽殼和麩皮為主料的培養(yǎng)基中,桑黃子實體正常出菇。其中日本桑黃菌絲生長13天滿袋,培養(yǎng)41～47天子實體形成,第80天子實體成熟即可采摘,平均干重產(chǎn)量可達29g/袋。而韓國桑黃菌絲則需17天長滿袋,培養(yǎng)第28～35天時子實體開始

3、形成,第48天子實體成熟并有孢子彈射,平均干重產(chǎn)量為18g/袋。兩種桑黃子實體培養(yǎng)條件相同,即:發(fā)菌階段于28℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng),出菇階段則為白天28℃,夜間18℃,相對濕度90％～95％,提供散射光,通氣良好(日通風3次,每次15min)。液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲球過程中,根據(jù)菌絲形態(tài)可將發(fā)酵周期分為四個階段,分別為適應期、生長期、成熟期和衰亡期。一級種培養(yǎng)7天即可獲得大量小菌絲球,二級種發(fā)酵5天便可獲得成熟菌絲球,黃綠色,平均干重產(chǎn)量為0.

4、613g/100mL。
　　 熱水回流法提取中以日本桑黃菌絲體粗多糖得率最高,為8.04％,而多糖提取率最高的是日本桑黃子實體,為4.36％。子實體多糖提取微波輔助法最佳條件為料液比1:45,功率450W,時間6.5min,多糖提取率為5.61％;復合酶法提取最佳條件為料液比1:90,時間140min,纖維素酶1.1％,木聚糖酶0.45％,β-葡聚糖酶1.25％,果膠酶0.3％,提取率可達6.82％,
　　 通過蒽酮-硫

5、酸法與苯酚-硫酸法所測結果的比較,選用苯酚-硫酸法測定總糖含量,還原糖含量測定采用DNS法,蛋白質含量用考馬斯亮藍G-250法測定,其中總糖含量以日本桑黃子實體粗多糖最高,為67.24％,還原糖含量則以韓國桑黃子實體粗多糖最多,高達11.02％,蛋白質以菌絲粗多糖含量最高,25.95％。多糖穩(wěn)定性檢測可知,85℃熱水中僅用162秒即可使多糖溶解完全,黑暗條件下多糖含量基本穩(wěn)定,同時,桑黃多糖還具有較好的抗還原性與抗氧化性。
　　

6、 水提所得粗多糖用不同濃度乙醇進行分級醇沉,日本桑黃子實體多糖80％醇沉多糖的總糖含量高達69.08％。Sevage法和三氯乙酸法脫蛋白結果差異明顯,最大脫除率分別為為76.96％和79.23％,最小多糖損失率分別為10.57％和20.71％。對脫蛋白多糖應用纖維素柱層析進行初步純化,其中日本桑黃子實體的純化多糖含糖量及蛋白質含量最高,為82.12％和8.53％。采用SePhadexG-100凝膠柱層析對多糖進行再次純化及純度檢驗,仍以

7、日本桑黃子實體所得均一多糖中糖含量與蛋白質含量最高,分別為87.11％和5.17％。
　　 最后,試驗通過肝癌HepG-2細胞體外抑制率檢測各多糖抑瘤率,不同純度多糖其抑瘤效果差異較大:日本桑黃子實體粗多糖、纖維素柱層析純化多糖及兩次凝膠柱層析均一多糖的癌細胞抑制率最高分別為51.20％,56.27％和33.87％,菌絲體多糖癌細胞抑制率最低,分別為35.73％,46.13％及25.87％。
　　 本試驗結果為桑黃這一抗