灰樹花子實體多糖的分離純化及免疫活性研究.pdf

1、灰樹花(Grifola frondosa)是一種生長在亞熱帶至溫帶的名貴珍稀藥食兩用真菌，又名貝葉多孔菌、云蕈、舞茸。在我國河北、浙江、四川、吉林、福建等省均有分布，并且在浙江、河北等省已實現規(guī)?；耘?，產量逐年增加。中醫(yī)認為灰樹花有“扶正固本”之效，東漢時期的《神農本草經》記載其“調和脾胃，安定神志”的功效?，F代醫(yī)學研究證明，灰樹花多糖具有顯著的抗癌、保肝、降血壓、提高免疫力等諸多藥理活性。灰樹花的營養(yǎng)和藥用價值，正引起愈來愈多學者的

2、關注。本文對灰樹花多糖進行了分離純化和結構的初步分析，追蹤檢測了所得各個灰樹花多糖的免疫活性，獲得具有免疫活性的灰樹花均一多糖，并深入探討了灰樹花均一多糖對巨噬細胞的活化作用，以期為灰樹花中藥資源和天然免疫藥物的開發(fā)提供理論依據。
　　 第一部分，灰樹花子實體多糖的提取和分離純化。采用熱水提取、乙醇分級沉淀法獲得灰樹花子實體粗多糖GFP75、GFP50和GFP30三個部分；利用DEAE-Seoharose FastFlow離子柱

3、層析對粗多糖GFP75進行純化，利用梯度洗脫的方法，得到GFP75-1、GFP75-2、GFP75-3、GFP75-4、GFP75-5和GFP75-6等六個灰樹花多糖組分；選取多糖GFP75-2、GFP75-3和GFP75-4進行Sephacryl S系列凝膠柱層析(GFP75-3先經離子柱層析再進行凝膠柱層析)，獲得四個灰樹花多糖，即GFP75-2C、GFP75-2D、GFP75-3C1、GFP75-4B；利用HPLC法檢測其純度，結

4、果顯示，所得四個灰樹花多糖為均一多糖。
　　 第二部分，灰樹花均一多糖的結構初步解析。采用現代色譜和光譜技術對得到的均一多糖進行了初步結構分析。高效液相色譜(HPLC)檢測結果顯示四個均一多糖GFP75-2C、GFP75-2D、GFP75-3C1、GFP75-4B的分子量分別是1.6×104Da、3×103Da、7.1×104Da和4.2×105Da。紫外光譜(UV)表明四種均一多糖均不含蛋白質和核酸等成分。運用高效陰離子色譜(

5、HPAEC)、紅外光譜(IR)和核磁共振(NMR)技術分析了四個均一多糖的糖環(huán)構型和單糖組成，結果顯示灰樹花多糖GFP75-2C是含有巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖的α-吡喃型中性雜多糖，灰樹花多糖GFP75-2D是含有巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖的呋喃型中性多糖，灰樹花多糖GFP75-3C1是含有巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的酸性多糖，灰樹花多糖GFP75.4B是含有巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、

6、葡萄糖、甘露糖的中性多糖。
　　 第三部分，灰樹花子實體多糖的免疫活性研究。運用活性追蹤的方法，利用巨噬細胞分泌NO實驗和小鼠淋巴細胞增殖實驗追蹤檢測了分離純化過程中得到的各個組分的免疫活性。粗多糖GFP75經體外刺激巨噬細胞分泌NO實驗和刺激小鼠淋巴細胞增殖實驗證明，其具有一定的體外免疫活性；通過體外細胞實驗，發(fā)現粗多糖GFP75-1、GFP75-2、GFP75-3、GFP75-4、GFP75-5和GFP75-6均有免疫活性，

7、其中，GFP75-2、GFP75-3和GFP75-4對巨噬細胞和淋巴細胞皆具有免疫活性，對這三個組分進一步純化獲得的四個均一多糖中，除灰樹花多糖GFP75-2C外，均有免疫活性，與相應的DEAE離子柱組分相比，灰樹花多糖GFP75-2D刺激巨噬細胞分泌NO活性顯著提高，灰樹花多糖GFP75-3C1刺激巨噬細胞分泌NO活性和刺激淋巴細胞增殖活性稍有提高，灰樹花多糖GFP75-4B刺激巨噬細胞分泌NO活性有所降低。
　　 第四部分，

8、灰樹花均一多糖GFP75-2D對巨噬細胞的活化作用研究。選取體外免疫活性顯著的灰樹花均一多糖GFP75-2D，研究了其對巨噬細胞免疫的活性機制。采用Griess法測定了灰樹花多糖對巨噬細胞NO釋放量的影響，酶聯免疫吸附法(ELISA法)檢測了灰樹花多糖對巨噬細胞分泌細胞因子的影響，RT-PCR法檢測灰樹花多糖對巨噬細胞表達相關細胞因子mRAN表達量的影響。研究發(fā)現，灰樹花多糖GFP75-2D對巨噬細胞有活化作用，刺激細胞體積變大，形成偽

9、足；與陰性對照相比，灰樹花多糖GFP75-2D處理后的RAW264.7細胞NO釋放量顯著增加，并且NO的釋放量與灰樹花多糖存在劑量依賴性；與未經樣品刺激組相比，灰樹花多糖GFP75-2D處理后的RAW264.7細胞分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6等細胞因子的量明顯增多，同時TNF-α、IL-1β和IL-6等細胞因子mRNA的表達量也增多。表明灰樹花多糖GFP75-2D能夠多途徑激活巨噬細胞，增強巨噬細胞的生物活性，具有良好的免疫增