嗜熱真菌木聚糖酶1YNA的表達(dá)、突變和酶特性研究.pdf

1、木聚糖酶能將木聚糖降解為低聚木糖和少量木糖。在飼料、食品和造紙行業(yè)等都有極大地應(yīng)用前景?，F(xiàn)在商業(yè)應(yīng)用的木聚糖酶大部分都是通過工程菌大規(guī)模發(fā)酵得到的。到目前為止，來源于不同生物的多種木聚糖酶已經(jīng)被成功表達(dá)于大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母和真菌等宿主。嗜熱真菌DSM10635所分泌的木聚糖酶屬于糖苷水解酶第11家族，其等電點(diǎn)為3.7，最適Ph是6.5，最適溫度是70℃，在Ph 5.5-9.0下都具有很高的酶活性。
　　 本論文通過簡并引物

2、對嗜熱真菌DSM10635的總DNA進(jìn)行PCR，從而獲得木聚糖酶的基因，序列比對后發(fā)現(xiàn)此木聚糖酶基因含有一個(gè)內(nèi)含子，采用重疊延伸PCR技術(shù)除去內(nèi)含子后，即得到木聚糖酶的編碼序列。將編碼序列與表達(dá)載體Pet-22b(+)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)得到有生物活性的木聚糖酶。酶特性分析的結(jié)果表明原核表達(dá)的木聚糖酶的最適溫度為65℃，比嗜熱真菌DSM10635分泌的木聚糖酶的最適溫度低了一些。其熱穩(wěn)定性也要差一些。

3、>　　 實(shí)驗(yàn)中我們對木聚糖酶基因進(jìn)行了一些突變并將突變后的木聚糖酶基因表達(dá)于大腸桿菌。通過突變引物利用PCR技術(shù)將突變引入到木聚糖酶基因中。所有的突變木聚糖酶都成功的表達(dá)于大腸桿菌。突變酶酶特性分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明突變酶發(fā)生了一些變化。N-端單個(gè)氨基酸的突變對木聚糖酶的性質(zhì)影響不大，但是加入二硫鍵后的木聚糖酶的性質(zhì)有了明顯的變化。加入二硫鍵后的木聚糖酶(如DSB1)的最適溫度為75℃，比未突變的1YNA增加了10℃。熱穩(wěn)定性也有了極大的