深海嗜熱細(xì)菌熱穩(wěn)定木聚糖酶的性質(zhì)及噬菌體GSVE1功能基因的研究.pdf

1、陸地資源開發(fā)已日趨飽和的今天，海洋資源的開發(fā)和利用日漸成為國際上關(guān)注的焦點(diǎn)。嗜熱微生物作為其中重要的組成部分，不僅在生物系統(tǒng)進(jìn)化中具有特殊地位，蘊(yùn)涵生命進(jìn)化歷程中豐富的信息；其代謝過程中特殊的產(chǎn)物，尤其是嗜熱酶在工業(yè)上有著廣闊的應(yīng)用前景，具有重要的研究意義。同時(shí)，對高溫噬菌體的深入研究，將有助于了解其獨(dú)特的生物化學(xué)和分子生物學(xué)特征，特別是相關(guān)結(jié)構(gòu)基因及尋找強(qiáng)啟動子方面的研究，將為嗜熱菌表達(dá)系統(tǒng)的人工載體構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。 本研究從太

2、平洋深海熱液區(qū)篩選分離到一株高產(chǎn)木聚糖酶的嗜熱菌MT-1，根據(jù)細(xì)菌16S rDNA序列分析，該嗜熱菌屬于Geobacillus sp.。從中克隆到一個(gè)編碼331個(gè)氨基酸的木聚糖酶基因，并在Escherichia coli中高效表達(dá)。酶學(xué)性質(zhì)測定結(jié)果表明，重組木聚糖酶的性質(zhì)與粗酶類似，其最適溫度和最適pH值分別為70℃和7.0，當(dāng)溫度高達(dá)90℃時(shí)，仍具有90％以上的酶活，且在pH5.5-10范圍內(nèi)均可檢測到較強(qiáng)的酶活。除了SDS對重組木聚

3、糖酶酶活具有顯著的抑制作用外，其他酶抑制劑PMSF、EDTA、2-ME、DTT(1mM)和去污劑Tween 20、Chaps、Triton X-100(0.1％)對酶活均無顯著影響。金屬離子對重組木聚糖酶酶活的影響研究表明，一價(jià)金屬離子(Li+、Na+、K+)對酶活略有促進(jìn)作用，除Mg2+、Ca2+、Ba2+以外的二價(jià)和三價(jià)金屬離子普遍對酶活有強(qiáng)烈的抑制作用。 目前，沒有適合于嗜熱細(xì)菌進(jìn)行蛋白重組表達(dá)的載體，為了探索采用噬菌體構(gòu)

4、建嗜熱菌表達(dá)系統(tǒng)，在本實(shí)驗(yàn)室已獲得的深海嗜熱細(xì)菌噬菌體GSVEl的基礎(chǔ)上，研究了噬菌體尾部蛋白的功能。根據(jù)噬菌體GSVEl全基因組測序結(jié)果和開放閱讀框的分析結(jié)果，對其中預(yù)測編碼噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白的vp192基因開展研究，以噬菌體基因組為模板，克隆了vp192基因，并在E. coli中進(jìn)行VP192蛋白的表達(dá)和純化，制備抗體；Northern blot和Western blot結(jié)果顯示，在噬菌體感染宿主菌后不同時(shí)期，vp192基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)

5、水平略有差異，大約在4h時(shí)達(dá)到最大值；免疫電鏡結(jié)果顯示，vp192基因如預(yù)測，編碼噬菌體尾部的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)蛋白。進(jìn)一步分析表明，該vp192基因處于一個(gè)尾部相關(guān)基因高度有序排列的功能基因簇的起始端，其下游的一段序列可能通過移碼翻譯的機(jī)制編碼兩個(gè)具有相同N末端的蛋白，隨之對該移碼翻譯機(jī)制進(jìn)行初步探索，將該段DNA序列克隆到帶有GST標(biāo)簽的pGEX-4T-2表達(dá)載體中，并用GST單克隆抗體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在兩種蛋白，分子量大小與預(yù)期一致