2428.深海嗜熱噬菌體gve2hnh核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)與功能的研究

1、掌短赤孽碩士學(xué)位論文密級(jí)保密期限深海嗜熱噬菌體GVE2HNH核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)與功能的研究StructuraIandfunctiorlaICharacterizationofdeep—seathermophiIiCbacteriophageGVE2HNHendonucIease學(xué)號(hào)姓名一級(jí)學(xué)科二級(jí)學(xué)科指導(dǎo)教師完成時(shí)間014201057徐丹丹生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)匿2017年5月摘要大部分的HNH核酸內(nèi)切酶都能切割35bp的雙鏈DNA片段

2、，具有DNA切割活性。大部分的HNH核酸內(nèi)切酶具有相似的結(jié)構(gòu)，包括兩條反向平行的B折疊片和一條0【螺旋及～個(gè)金屬離子結(jié)合中心。深海嗜熱噬菌體GVE2(deep—seathermophilicbacteriophageGeobacillusvirusE2)HNH核酸內(nèi)切酶在噬菌體的生命周期中作為一個(gè)很重要的組裝機(jī)器，對(duì)噬菌體的繁殖及侵染有很重大的意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)的方法解析了高分辨率的GVE2HNHEMn2和GVE2HNHEZn

3、2十的三維結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)構(gòu)和生化兩方面深入的研究了深海嗜熱噬菌體HNH核酸內(nèi)切酶的作用機(jī)制。這是深海嗜熱噬菌體內(nèi)HNH核酸內(nèi)切酶的首次研究報(bào)道。生物信息學(xué)分析表明GVE2HNHE屬于HNH核酸內(nèi)切酶超家族的一員。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)構(gòu)比較顯示，除了含有額外的n螺旋之外，GVE2HNHE具有與來(lái)自其它噬菌體的HNH內(nèi)切核酸酶類(lèi)似的典型的BpQ金屬折疊結(jié)構(gòu)和Zn指狀基序，這表明在噬菌體中這些酶具有很高的保守性。生化實(shí)驗(yàn)研究表明，HNH結(jié)構(gòu)域中的

4、保守氨基酸H93，N109和H118的突變體H93A，N109A和H118A分別降低了90％、80％、60％的切割活性。通過(guò)圓二色譜實(shí)驗(yàn)分析，與野生型GVE2HNHE相比突變體H93A的構(gòu)象并未發(fā)生很大的變化，突變體N109A和H118A的整體構(gòu)象發(fā)生了很大變化。除此之外，通過(guò)圓二色譜測(cè)定野生型GVE2HNHE和突變體蛋白的熱穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，突變體蛋白(H93A，N109A和H118A)的熱穩(wěn)定性與野生型相比下降了很多。Mn2和Zn抖對(duì)GV

5、E2HNHE的切割活性的影響各不相同。然而高濃度的錳離子對(duì)突變體N109A和Hll8A對(duì)DNA的切割活性產(chǎn)生促進(jìn)作用，鋅離子會(huì)抑制二者的切割活性。通過(guò)與其它類(lèi)型的HNH核酸內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)比較，發(fā)現(xiàn)GVE2HNHE的構(gòu)象與其它核酸酶的構(gòu)象有很大不同，這也許是這種酶高溫耐熱的基本原因。本文通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法解析了深海嗜熱噬菌體GVE2HNH核酸內(nèi)切酶的兩種高分辨率三維結(jié)構(gòu)，并通過(guò)后續(xù)的生化實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證了核酸內(nèi)切酶的生理生化特性，為HNH