噬菌體聚糖酶在細(xì)菌生物被膜降解中的應(yīng)用研究.pdf

1、細(xì)菌生物被膜(biofilm，BF)的控制是食品工業(yè)的一大難題，它為被膜菌在不良環(huán)境下的存活和生長(zhǎng)提供了一種保護(hù)性結(jié)構(gòu)，使其更容易引發(fā)食品腐敗、設(shè)備腐蝕和食源性疾病等危害。普通的消毒殺菌措施很難實(shí)現(xiàn)對(duì)成熟生物被膜細(xì)菌的徹底清除，甚至導(dǎo)致細(xì)菌的抗藥性造成更嚴(yán)重的后果。生物被膜的主要組成成分為胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)，借助于噬菌體及其聚糖酶的酶解技術(shù)，為降解生物被膜提供了一種新型安全高效的方法。本文以克雷伯氏菌

2、血清型K13為出發(fā)菌株，侵染K13的噬菌體P13及其聚糖酶為工具，研究了噬菌體及其酶對(duì)生物被膜的降解作用。
　　 生物被膜是細(xì)菌在一定條件下接觸各種材質(zhì)表面時(shí)的一種生長(zhǎng)形式，菌體細(xì)胞之間以胞外物質(zhì)相互連結(jié)在一起形成空間網(wǎng)狀具有一定密度的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)幫助細(xì)菌抵制各種不良環(huán)境而使其更好的生存、生長(zhǎng)和繁殖。細(xì)菌胞外多糖是胞外物質(zhì)的主要成分，和無(wú)機(jī)鹽離子、菌體、水等共同構(gòu)成生物被膜。由添加KH2PO4和葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)構(gòu)建了

3、生長(zhǎng)于玻璃片上的生物被膜，定性染色法及定量平板擦拭計(jì)數(shù)法表明克雷伯氏菌K13在培養(yǎng)一天時(shí)形成成熟的生物被膜。
　　 噬菌體聚糖酶能夠高效降解細(xì)菌胞外多糖并具有良好的熱穩(wěn)定性。該酶在噬菌體侵染細(xì)菌并結(jié)合至宿主細(xì)胞表面的多糖物質(zhì)時(shí)被釋放出來(lái)，隨之多糖物質(zhì)被酶解，進(jìn)而噬菌體能夠到達(dá)細(xì)菌表面受體裂解細(xì)菌。噬菌體聚糖酶經(jīng)過(guò)1:2添加比的丙酮沉淀后可達(dá)到最大限度的濃縮，從而達(dá)到較高的酶活，同時(shí)消除了大部分噬菌體。經(jīng)75℃10分鐘處理后，初始

4、效價(jià)為2.3×109PFU/ml的K13噬菌體被完全滅活，而這種熱處理方式仍能保證該酶較高的酶活。
　　 噬菌體聚糖酶對(duì)生物被膜具有顯著降解作用，平板擦拭計(jì)數(shù)法顯示酶處理4h對(duì)生物被膜細(xì)菌數(shù)量的影響最為顯著，80％的細(xì)菌被清除。含有噬菌體聚糖酶的噬菌體裂解液對(duì)生物被膜也表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解作用，在處理4 h時(shí)可達(dá)到88％的被膜菌清除率。噬菌體聚糖酶預(yù)處理還可有效提高消毒劑二氧化氯對(duì)生物被膜細(xì)菌的清除率。實(shí)驗(yàn)通過(guò)掃描電鏡(scanni

5、ng electron microscope，SEM)觀察酶處理不同時(shí)間的生物被膜中被膜菌及胞外多糖的結(jié)構(gòu)變化、單位面積生物被膜細(xì)菌群落數(shù)量的變化，觀察結(jié)果表明，噬菌體聚糖酶能夠有效減少處于連結(jié)狀態(tài)的細(xì)菌和生物被膜中的胞外物質(zhì)，當(dāng)酶作用6 h時(shí)，單位面積視野內(nèi)僅剩下少量的被膜菌，被膜菌之間的連結(jié)物質(zhì)幾乎全部被清除。研究表明K13噬菌體聚糖酶對(duì)生物被膜具有高效的降解性能，有可能開(kāi)發(fā)成為一種去除生物被膜的重要工具。
　　 利用噬菌體