噬菌體在燒傷泛耐藥細(xì)菌感染治療中的應(yīng)用研究.pdf

1、感染是嚴(yán)重?zé)齻闹饕l(fā)癥，輕者可延誤創(chuàng)面愈合，重則可誘發(fā)膿毒癥，甚至多器官功能衰竭，是燒傷死亡的主要原因。嚴(yán)重?zé)齻颊哂捎隗w表生理防御屏障受損、全身免疫功能下降、壞死組織廣泛存在以及外界或自身菌群侵襲，其感染易感性大大增加。因此，燒傷感染的防治一直是燒傷救治領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題[1，2]。
　　隨著抗生素在臨床上長(zhǎng)期、廣泛和大量使用，細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)及日益嚴(yán)重化給臨床抗感染治療帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[3]。而燒傷病房中常見(jiàn)的細(xì)菌鮑曼不動(dòng)

2、桿菌(Acinetobacter baumannii)[3,4]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[5-8]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[3,9-11]和克雷伯桿菌（Klebsiella pneumoniae）[10]等都是目前報(bào)道的耐藥率很高，耐藥現(xiàn)象非常普遍的幾大類細(xì)菌。由于傳統(tǒng)的抗生素的研發(fā)進(jìn)展非常緩慢，亟需其他的抗菌手段。在本次課題中，我們主要做了以下四個(gè)方面的研究:

3、1）對(duì)自己醫(yī)院燒傷病房的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行了廣泛和全面的分子流行病學(xué)調(diào)查;2）分析噬菌體內(nèi)溶素PlyAB1在應(yīng)對(duì)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染中的應(yīng)用;3）用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步分析了鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體Abp1的安全性和有效性;4）分析CRISPR在抗感染領(lǐng)域的應(yīng)用。結(jié)果總結(jié)如下:
　　1.對(duì)3年來(lái)的燒傷患者血液分離鮑曼不動(dòng)桿菌分析，共收集到81株細(xì)菌。大多數(shù)菌株為多重耐藥菌株。除了多粘菌素B尚未發(fā)現(xiàn)有耐藥菌株外，米諾環(huán)素和頭孢哌酮鈉舒巴

4、坦鈉的耐藥率在30％和75％左右，剩下16種抗生素耐藥率高達(dá)90％以上。同時(shí)，這些細(xì)菌中耐藥基因檢出率高，檢測(cè)率較高的耐藥基因依次是OXA51、OXA23、AmpC、IS-AmpC、PER和SIM，其檢測(cè)率分別是96.3％，92.6％，86.4％，72.7％，72.7％和51.9％。81株血液分離菌被分到28個(gè)ST型別中，包含了10個(gè)已知的ST型別和18個(gè)新的ST型別。除了5個(gè)ST型（ST457，STn2，STn6，STn11和STn1

5、4）不屬于同一個(gè)克隆群，其余23個(gè)ST型的菌株（共76株）均屬于同一個(gè)克隆群，克隆復(fù)合體92。這也是目前世界上流行最多的鮑曼不動(dòng)桿菌克隆復(fù)合體。
　　2.進(jìn)一步對(duì)三年來(lái)分離的耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行分析，共收集了248株細(xì)菌。主要分離部位依次是傷口表面(41％)、痰液(24％)、導(dǎo)管(15％)和血液(14％)四個(gè)部位，共占了全部樣本的94％。耐藥基因OXA23的檢出率呈現(xiàn)了上升趨勢(shì)，OXA23的檢出率從2012年的39％升高至

6、2013年的77％。而且在不同的ST型別的細(xì)菌中，OXA23的攜帶率明顯不同，在ST95和ST191中，OXA23的檢出率僅為10％，但是在ST369中，90％(26/29)的菌株攜帶有OXA23基因。ST368始終是過(guò)去三年中的主導(dǎo)型別，但它所占的比例有所下降。同時(shí)ST型別組成也是每年都在發(fā)生變化，部分ST型別消失，部分新ST型別顯現(xiàn)出來(lái)。進(jìn)化分析提示這248株耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌大部分遺傳關(guān)系相近，這也提示我們控制醫(yī)院感染是鮑曼不

7、動(dòng)桿菌感染防治中的重要一步。
　　3.經(jīng)過(guò)兩次去內(nèi)毒素純化后，噬菌體原液中內(nèi)毒素的含量降低了400多倍，從7.03*105EU/ml降低到了1.70*103EU/ml。使用Hela細(xì)胞和THP-1細(xì)胞研究了噬菌體對(duì)細(xì)胞的體外毒性作用，證實(shí)高達(dá)1010PFU/ml的噬菌體作用過(guò)夜后未檢測(cè)到明顯的細(xì)胞毒性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，Hela細(xì)胞感染鮑曼不動(dòng)桿菌2個(gè)小時(shí)后，給予MOI為100的噬菌體治療，可以達(dá)到拯救細(xì)胞被細(xì)菌感染而殺死的目的。最后

8、，使用創(chuàng)面局部感染鮑曼不動(dòng)桿菌和小鼠全身感染鮑曼不動(dòng)桿菌模型，證實(shí)了噬菌體Abp1對(duì)于AB1引起的局部感染和全身感染都有很好的治療作用。
　　4.基于前期的噬菌體基因組測(cè)序，尋找到了一個(gè)新的鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體內(nèi)溶素，進(jìn)一步克隆表達(dá)和純化了該內(nèi)溶素PlyAB1。證實(shí)PlyAB1蛋白約21Kda左右，PlyAB1能迅速裂解鮑曼不動(dòng)桿菌AB1，使得其OD600在30分鐘內(nèi)從1.0下降至0.2，活菌數(shù)量從1.4×107CFU/ml降至4.

9、1×106CFU/ml。除了宿主菌AB1，還能裂解臨床分離的屬于不同型別的48株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌。
　　5.最后，使用CRISPR技術(shù)，通過(guò)抑制細(xì)菌的prtR基因的表達(dá)，控制細(xì)菌的數(shù)量。首先，我們成功將CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功置入到銅綠假單胞菌中，進(jìn)而用攜帶CRISPR-Cas9系統(tǒng)的重組質(zhì)粒PHERDB20T-dCas9-prtR sgRNA證實(shí)它可以降低銅綠假單胞菌達(dá)103倍數(shù)量級(jí)。這些結(jié)果也證實(shí)了CRISPR技術(shù)在抗