亞羅解脂假絲酵母脂肪酶的高水平重組表達(dá)、分子體外進(jìn)化研究及其在手性拆分中的應(yīng)用.pdf_第1頁(yè)
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1、脂肪酶(lipase,EC3.1.1.3)是一種重要的工業(yè)酶類,廣泛應(yīng)用于食品、油脂化工、制藥和有機(jī)合成工業(yè)中,酶催化的反應(yīng)具有條件溫和、耗能低、原料要求低、成品質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn),具有巨大的應(yīng)用潛力。本實(shí)驗(yàn)室培育的亞羅解脂假絲酵母Candidasp.99-125所生產(chǎn)的胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)活性高、催化活性強(qiáng),已經(jīng)被成功應(yīng)用于油脂改性、多元醇酯合成、手性化合物拆分和可替代能源(生物柴油)合成等等,是工業(yè)生產(chǎn)中重要的催化劑。為了進(jìn)

2、一步促進(jìn)和拓展假絲酵母脂肪酶YlLip2的商業(yè)化應(yīng)用和生產(chǎn),本文主要進(jìn)行了如下工作:
   1、研究了固定化假絲酵母脂肪酶YlLip2用于外消旋α-苯乙胺的動(dòng)力學(xué)拆分。本實(shí)驗(yàn)中,本文首次利用了含有機(jī)助劑的介質(zhì)作為脂肪酶催化外消旋α-苯乙胺發(fā)生選擇性酰基化反應(yīng)的體系,實(shí)現(xiàn)了外消旋α-苯乙胺兩種對(duì)映體的拆分。在動(dòng)力學(xué)拆分的過(guò)程中,脂肪酶YlLip2具有R型對(duì)映體優(yōu)先選擇性且對(duì)映體過(guò)量值由于3%(v/v)極性有機(jī)助劑DMSO的加入得到

3、了顯著增長(zhǎng),對(duì)映體過(guò)量值(e.e.p)由0.35增長(zhǎng)到了0.96,對(duì)映體比率(E)提高約20倍,最終達(dá)到190;而E值大于50一般即認(rèn)為具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。這是該酶首次應(yīng)用于手性胺類的拆分。
   2、由于芽孢桿菌具有高效、功能性表達(dá)外源蛋白的優(yōu)勢(shì),本文研究了假絲酵母脂肪酶YlLip2在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)體系中的重組表達(dá)策略。首先,構(gòu)建了基于游離型質(zhì)粒的表達(dá)平臺(tái)。通過(guò)分離、克隆了多個(gè)枯草芽胞桿菌內(nèi)的表

4、達(dá)元件,包括組成型啟動(dòng)子(PdegQ、PglpD和PaprE)和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PamyE、PsacB),以及α-淀粉酶的信號(hào)肽和終止子序列,構(gòu)建了一系列新的分泌型表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒中插入脂肪酶基因YlLip2后,轉(zhuǎn)化蛋白酶缺失型的枯草芽胞桿菌DL3p菌株,實(shí)現(xiàn)了重組脂肪酶的分泌性表達(dá),胞外酶活表達(dá)水平達(dá)到0.2-4.5U/mg總蛋白。另一方面,本文研究并建立了一種新的枯草芽孢桿菌內(nèi)染色體整合方法。以全長(zhǎng)的單鏈DNA為電轉(zhuǎn)化底物,利用枯草芽胞

5、桿菌自身的同源整合機(jī)制,實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單、高效的在枯草芽孢桿菌染色體上進(jìn)行外源基因的整合及目標(biāo)基因的替換。以脂肪酶YlLip2為驗(yàn)證對(duì)象,通過(guò)多重融合PCR構(gòu)建了兩端具有同源臂的融合蛋白表達(dá)框,并通過(guò)不對(duì)稱PCR、5’端硫代磷酸化修飾等手段制備了全長(zhǎng)型的單鏈DNA表達(dá)框作為底物,電轉(zhuǎn)化后實(shí)現(xiàn)了該脂肪酶表達(dá)框在染色體上amyE位點(diǎn)的基因替換(即雙交換整合),且重組脂肪酶rYlLip2實(shí)現(xiàn)了功能性表達(dá),酶活約為0.91U/mg總蛋白。該方法對(duì)枯草

6、芽孢桿菌內(nèi)重組蛋白表達(dá)、基因功能研究等都具有很大的意義。
   3、為了提高假絲酵母脂肪酶的表達(dá)水平,進(jìn)一步降低其生產(chǎn)成本,本文研究了假絲酵母脂肪酶在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)宿主中的高效表達(dá)。重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Lip2轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株后整合于染色體中,在100μg/mLZeocin平板上篩選得到的重組菌株#0-8號(hào)經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后,在5升發(fā)酵罐內(nèi)產(chǎn)酶水平可達(dá)到4580U/mL發(fā)酵液,且發(fā)酵液

7、中rYlLip2的表達(dá)量達(dá)到1.05g/L發(fā)酵液,重組蛋白含量可以占到總蛋白的50%以上。為了進(jìn)一步提高重組蛋白的表達(dá)水平,本文又對(duì)重組畢赤酵母進(jìn)行了多拷貝子的篩選。在500μg/mLZeocin高抗生素濃度下成功篩選得到脂肪酶高產(chǎn)菌株#2-8號(hào)和#3-5號(hào)兩個(gè)多拷貝菌株,搖瓶產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)#2-8號(hào)菌株胞外重組脂肪酶活性可達(dá)到350U/mL,與單拷貝子#0-8號(hào)菌相比提高了30%;而在5升發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液中酶活達(dá)到11000U/mL,與#

8、0-8號(hào)相比提高了150%。重組蛋白含量達(dá)到了2.3g/L發(fā)酵液,時(shí)空產(chǎn)量達(dá)到67900U/L/h。由此,重組假絲酵母脂肪酶YlLip2的表達(dá)量得到了顯著提高,實(shí)現(xiàn)了重組脂肪酶的高水平表達(dá)。經(jīng)Southernblot印跡雜交分析確定脂肪酶高產(chǎn)菌株#2-8和#3-5為多拷貝轉(zhuǎn)化子,拷貝數(shù)約為3。
   4、亞羅解脂假絲酵母脂肪酶作為一種具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的脂肪酶,其熱穩(wěn)定性卻較差,妨礙了該酶的應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化。在本實(shí)驗(yàn)中,我們以提高脂肪

9、酶YlLip2的熱穩(wěn)定性為目標(biāo),分別利用分子定向進(jìn)化技術(shù)、半理性設(shè)計(jì)方法B-FIT對(duì)酶進(jìn)行改造,獲得了多個(gè)熱穩(wěn)定性提高的突變酶,包括單點(diǎn)突變體F237C、A103S和T117G,將酶在50℃下的半衰期t1/2由2min提高至了5.5min。而后通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了多位點(diǎn)組合突變體并進(jìn)行了分析、鑒定。其中,熱穩(wěn)定性最高的組合突變體T117G/F237C在50℃下的半衰期達(dá)到14.4min,與原始酶相比提高了7倍以上。通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬,

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