分子鉗改性載體材料的制備及脂肪酶手性拆分.pdf

1、脂肪酶是一類非常重要的生物水解酶，脂肪酶的活性結(jié)構(gòu)的主要特征包括水解酶折疊（中心由疏水的β-折疊被α-螺旋從兩側(cè)覆蓋），活性位點(diǎn)由Ser-His-Asp/Glu三聯(lián)體和一個(gè)氧負(fù)離子洞組成，并且在大多數(shù)情況下，α-螺旋覆蓋活性位點(diǎn)形成“蓋子”。結(jié)構(gòu)功能研究表明，內(nèi)部隧道和“蓋子”的形態(tài)、尺寸和氨基酸的組成，對于脂肪酶的催化多功能性至關(guān)重要。膽汁鹽分子是一種生物表面活性劑，具有極性面和非極性面的兩親性分子，空間體積大，呈剛性，無毒可降解，生

2、物兼容性好。膽汁鹽對脂肪酶具有界面誘導(dǎo)活化的功能，從而促進(jìn)脂肪酶的手性催化能力。因此，本文將脂肪酶與膽汁鹽結(jié)合后，可望提高脂肪酶在外消旋氨基酸甲酯酯交換反應(yīng)中的手性拆分性能。
　　本文采用脫氧膽酸為骨架，對其結(jié)構(gòu)上的兩個(gè)羥基進(jìn)行接枝改性，制備了具有兩條“手臂”和一個(gè)“裂穴”的手性不對稱脲脫氧膽酸類分子鉗。首先通過紫外分光光度滴定法測定了分子鉗與氨基酸甲酯之間的識別性能;然后將分子鉗與脂肪酶混合用于測定外消旋氨基酸甲酯酯交換反應(yīng)，通

3、過高效液相色譜法測定其催化性能;最后本文選取了六種膽汁鹽，考察了不同膽汁鹽在不同濃度作用下豬胰脂肪酶(PPL)對酶促反應(yīng)催化性能的影響。具體的研究結(jié)論如下:
　　1.脂肪酶(PPL)經(jīng)過六種膽汁鹽處理后，對脂肪酶活性的影響基本一致:隨著膽汁鹽濃度的上升，脂肪酶的活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，并且在不同膽汁鹽各自的臨界膠束濃度(CMC)值附近達(dá)到最大值。這表明在一定濃度范圍內(nèi)的膽汁鹽處理脂肪酶后，其對映體選擇性和催化活性同時(shí)得到了提

4、高。
　　2.通過核磁手段驗(yàn)證了合成分子鉗結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。通過差紫外光譜滴定法測定了主體分子鉗和客體氨基酸甲酯間的相互作用，配合物的最大吸光度呈現(xiàn)出規(guī)律性的上升，再根據(jù)結(jié)合常數(shù)Ka和自由能變化值-ΔG0判定了主客體間存在相互作用并產(chǎn)生了手性識別。分子鉗與L-氨基酸甲酯的結(jié)合常數(shù)比與D-氨基酸甲酯的結(jié)合常數(shù)高（纈氨酸甲酯除外），說明分子鉗優(yōu)先于L-氨基酸甲酯結(jié)合;并且分子鉗對色氨酸甲酯的作用最強(qiáng)。這主要是因?yàn)長-色氨酸甲酯在空穴內(nèi)接近

5、C7和C12位上的脲基團(tuán)手臂，而D-色氨酸甲酯則接近C3位，因此L-色氨酸甲酯與分子鉗的結(jié)合作用強(qiáng)于D-色氨酸甲酯。
　　3.根據(jù)酶促反應(yīng)的高效液相色譜法測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在酯交換反應(yīng)中加入脂肪酶PPL后，酯交換反應(yīng)的選擇性有了顯著的提高，而活性卻有所下降;在脂肪酶的基礎(chǔ)上加入分子鉗后，選擇性有小幅度的上升，活性也有所提高。這說明手性不對稱脲脫氧膽酸分子鉗對脂肪酶的催化性能有所影響，但不是特別的明顯。在六種分子鉗中，加入色氨酸分子鉗與