可拆分獲得（S）-Ketoprofen脂肪酶基因的研究.pdf

1、近年來(lái),利用生物系統(tǒng)獲得光學(xué)純化合物已經(jīng)逐漸成為化學(xué)合成方法之外的另一選擇。2-芳基丙酸類(lèi)藥物是一類(lèi)重要的非甾體抗炎藥,利用微生物中脂肪酶立體選擇性的拆分,獲得具有光學(xué)活性的2-芳基丙酸類(lèi)藥物(如酮基布洛芬和萘普生)的單一對(duì)映體己成為研究的熱點(diǎn)。 本文以本實(shí)驗(yàn)室篩選出的一株具有一定不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)化外消旋酮基布洛芬氯乙酯生成(S)-酮基布洛芬能力的野生菌NK13為材料,通過(guò)提取NK13基因組DNA、Sau3AI部分酶切,回收1～6kb大

2、小的DNA片段,與經(jīng)BamHI酶切的pUC18載體連接,轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建了該菌的基因文庫(kù)。 從基因文庫(kù)中篩選獲得一株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,并對(duì)該轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒中的外源片段進(jìn)行了測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析表明：插入外源片段的長(zhǎng)度為2826bp,其中包含一段完整的633bp的開(kāi)放閱讀框,編碼由210個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白。將633bp的基因序列和其編碼的蛋白序列與NCBI中已知基因序列和蛋白序列進(jìn)行同源性比對(duì),結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)

3、與基因同源的序列,與該基因編碼的蛋白同源性最高的為Bacillus subtilis subsp. esterase, 同源性為85％。設(shè)計(jì)引物、PCR擴(kuò)增脂肪酶目的基因,連入pET-21b(+)載體,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建了該脂肪酶的表達(dá)重組菌,SDS-PAGE電泳檢測(cè)證明該脂肪酶成熟蛋白分子量約為20KDa。證明該基因是一新基因,已提交GenBank(登錄號(hào)為EU381317)。 用薄層層析和高

4、效液相色譜對(duì)表達(dá)重組菌轉(zhuǎn)化酮基布洛芬氯乙酯的能力進(jìn)行了鑒定,隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)化率逐漸增加,(S)-酮基布洛芬過(guò)量值(e.e.％)逐漸減少。表達(dá)重組菌4h時(shí)轉(zhuǎn)化約20％消旋酮基布洛芬氯乙酯,生成(S)-酮基布洛芬e.e.％最高,達(dá)75.28％；8h的轉(zhuǎn)化率達(dá)到50％；10h時(shí)的轉(zhuǎn)化率約為55％,(S)-酮基布洛芬e.e.％保持在72.90％；20h時(shí)的轉(zhuǎn)化率接近90％,(S)-酮基布洛芬e.e.％降低到39.46％。野生菌NK13的

5、24h的轉(zhuǎn)化率大約為40％,(S)-酮基布洛芬e.e.％最高為5.84％。說(shuō)明,在未進(jìn)行條件優(yōu)化的情況下,表達(dá)重組菌無(wú)論是轉(zhuǎn)化率還是(S)-酮基布洛芬光學(xué)純度都比野生型NK13有了很大的提高,表達(dá)重組菌的轉(zhuǎn)化時(shí)間縮短了一半以上,而生成(S)-酮基布洛芬e.e.％是野生菌的15倍。 如果能夠進(jìn)一步優(yōu)化重組表達(dá)菌株的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化條件,以期找到拆分得到(S)-酮基布洛芬過(guò)量100％的最適條件,這樣就有可能將工程菌用于大量生產(chǎn)(S)-酮基布