用于拆分制備L-薄荷醇的脂肪酶基因克隆和表達(dá).pdf

1、本文從實(shí)驗(yàn)室保藏的能有效拆分制備L-薄荷醇的菌株中克隆脂肪酶(Pseudomonas alcaligenes X1和Stenotrophomonas maltophilia X2)，實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中高效表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究。
　　分別構(gòu)建了兩個(gè)菌種的基因文庫(kù)，通過(guò)平板水解圈法初篩以及氣相色譜驗(yàn)證，成功克隆到序列長(zhǎng)度分別為1575bp的pal和1518bp的sml，通過(guò)氨基酸序列的分析，兩酶都包含活性中心GISYG

2、，該酶屬于Serine水解酶類型，催化中心包括Ser-Asp-His。通過(guò)氨基酸序列對(duì)比，構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)及結(jié)構(gòu)分析。
　　以pET30a(+)為載體，E.coil BL21(DE3)為宿主實(shí)現(xiàn)兩酶的表達(dá)，蛋白大小為51kDa。經(jīng)優(yōu)化表達(dá)后，兩酶的水解p-NPO活力分別達(dá)到89000U/L和90600U/L。經(jīng)鎳離子柱親和純化后，對(duì)兩酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，分別考察了酶反應(yīng)的最適溫度、pH、底物特異性以及金屬離子對(duì)酶的作用。利用重組脂肪酶