畢赤酵母表面展示CALB全細(xì)胞脂肪酶催化劑的發(fā)酵優(yōu)化及其在天然維生素C改性中的應(yīng)用.pdf

1、維生素C作為天然抗氧化劑備受青睞，但不具有脂溶性極大地限制了其應(yīng)用。隨著兩步發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)的成熟，全球維生素C產(chǎn)能過(guò)剩危機(jī)嚴(yán)重。因此，維生素C改性對(duì)擴(kuò)展其使用范圍，增加其附加值，緩解產(chǎn)能過(guò)剩有重要的現(xiàn)實(shí)意義。對(duì)維生素C改性，生物法與化學(xué)法相比更具優(yōu)勢(shì)，但是目前生物酶制劑價(jià)格昂貴，制作繁瑣。本論文對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)高效低成本的新型固定化生物催化劑-脂肪酶全細(xì)胞催化劑及其催化合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的工藝路線進(jìn)行研究。
　　 首先對(duì)自主構(gòu)建

2、的畢赤酵母表面展示假絲酵母脂肪酶B(CALB)全細(xì)胞催化劑發(fā)酵、產(chǎn)酶關(guān)鍵條件進(jìn)行優(yōu)化。Invitrogen公司操作手冊(cè)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化后菌體富集BMGY培養(yǎng)基甘油含量為4％，裝液量為25mL/250mL，轉(zhuǎn)速為250r/min，發(fā)酵菌體密度OD600由優(yōu)化前的24.68提高到55.4；誘導(dǎo)產(chǎn)酶BMMY培養(yǎng)基裝液量為25mL/250mL，轉(zhuǎn)速為250 r/min，甲醇的初始添加量為1％，每24h添加0.75％，誘導(dǎo)144h，單位發(fā)酵液的酶活

3、力由優(yōu)化前的11.7 U/mL，升高到30.5U/mL。
　　 對(duì)畢赤酵母表面展示CALB全細(xì)胞催化劑的酶學(xué)特性進(jìn)行研究。在催化對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯的水解過(guò)程中，其最適反應(yīng)pH是8，最適反應(yīng)溫度范圍是40℃。同時(shí)，熱穩(wěn)定研究表明畢赤酵母表面展示CALB具有良好的穩(wěn)定性，40℃恒溫4h，仍能保持88％以上的水解活力。50℃恒溫6h殘存酶活仍在50％以上。
　　 L-抗壞血酸脂肪酸酯合成必須在非水相中進(jìn)行，為獲得干燥、催化酯合

4、成效率高的畢赤酵母表面展示CALB全細(xì)胞催化劑，對(duì)其凍干條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的凍干條件為：pH為7.5的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行pH“記憶”，油酸進(jìn)行印跡，以5％脫脂乳/5％海藻糖(1:1)作為凍干保護(hù)劑進(jìn)行凍干，酶活提高5倍左右。
　　 應(yīng)用畢赤酵母表面展示CALB凍干粉在有機(jī)相中合成L-抗壞血酸脂肪酸酯。優(yōu)化后的合成條件為：四氫呋喃作為反應(yīng)介質(zhì)，5 mL反應(yīng)體系中加入L-抗壞血酸(100 mmol)和棕櫚酸(L-抗壞血酸/棕櫚酸=1