粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)研究.pdf

1、目的：通過具有創(chuàng)新性的基因工程手段獲得粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)基因，并將其按照酵母偏愛密碼子優(yōu)化，消除自然序列中存在的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，然后導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，使其誘導(dǎo)表達(dá)，獲得具有生物活性且具有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值的GM-CSF。 方法：首先從人體基因組克隆得到hGM-CSF全基因，然后通過采用引物5'端加長(zhǎng)法克隆了含127個(gè)編碼氨基酸的hGM-CSF，在引物克隆過程中對(duì)該基因做了局部的密碼子優(yōu)化。最后通過高保真T

2、aq酶擴(kuò)增和EcoRI單酶切的方法將該基因整合進(jìn)畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K，通過電擊轉(zhuǎn)化和甲醇誘導(dǎo)篩選，最終獲得一株搖瓶水平粗蛋白表達(dá)量達(dá)3.89g/l的轉(zhuǎn)化子。 結(jié)果：PCR、SDS-PAGE與westeran blotting免疫雜交證實(shí)hGM-CSF活性正常。SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)所表達(dá)的hGM-CSF均發(fā)生了糖基化，通過N-糖苷酶F去糖基化也證實(shí)了這點(diǎn)。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了可高效表達(dá)、有效分泌hGM