重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子發(fā)酵工藝和液相色譜法對其復性并同時純化.pdf

1、本論文先對大腸桿菌(E.coli)表達的rhGM-CSF進行了發(fā)酵工藝和放大工藝的研究和優(yōu)化，得到高表達、高產量的包涵體，然后分別用疏水色譜(HPHIC)、離子交換色譜(HPIEC)、排阻色譜(SEC)對rhGM-CSF進行了復性并同時純化。全文包括以下五個部分： 1.介紹了蛋白質復性的意義，對近年來發(fā)展起來的蛋白質復性新方法進行了系統(tǒng)地綜述。對rhGM-CSF的復性及分離純化研究進展進行了評述。 2.rhGM-CSF搖

2、瓶發(fā)酵工藝和放大工藝的研究通過搖瓶發(fā)酵對大腸桿菌DH5α/pDH生產rhGM-CSF的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、誘導時機、誘導維持時間、接種量等進行了研究，選擇了較好的搖瓶培養(yǎng)條件。結果表明，大腸桿菌適宜在32℃進行培養(yǎng)，在對數(shù)生長前期升溫至42℃誘導4～5小時，可獲得較高的表達量rhGM-CSF。同時進行了發(fā)酵工藝的放大研究。 3.HPHIC對rhGM-CSF復性并同時純化成功應用高效疏水色譜(HPHIC)對E.coli表達的rhGM

3、-CSF進行了復性和純化，研究了固定相、鹽種類、流動相pH、流動相中脲濃度，GSH/GSSG比例等因素對rhGM-CSF復性和純化的影響。在優(yōu)化條件下，經一步HPHIC可以得到比活為1.58×107IU/mg，純度為95.7％，質量回收率為56.8％的rhGM-CSF。 4.HPIEC對rhGM-CSF復性并同時純化采用HPIEC法成功對7.0mol/L鹽酸胍變性的rhGM-CSF進行了復性并同時純化，考察了流動相pH、流動相中

4、脲濃度、GSH/GSSG比例等因素對rhGM-CSF復性的影響。結果表明，GSSG/GSH可有效提高rhGM-CSF二硫鍵的正確對接和復性效率，而低濃度的脲則可有效抑制蛋白沉淀，可大大提高質量回收率。在最優(yōu)化條件下，HPIEC一步可使rhGM-CSF在分離純化的同時進行復性，其比活為1.66×107IU/mg，質量回收率為58.8％，純度可達到96.2％。 5.SEC對rhGM-CSF復性并同時純化應用SEC法對rhGM-CSF