提高人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子在植物中表達(dá)的策略研究.pdf

1、外源基因在宿主體內(nèi)的表達(dá)水平是決定生物反應(yīng)器能否產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。制約植物生物反應(yīng)器應(yīng)用的主要問(wèn)題是，外源蛋白在植物體內(nèi)的累積水平低，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品沒(méi)有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力。若要實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)，理論上外源蛋白的表達(dá)量應(yīng)達(dá)到植物總可溶性蛋白的1％以上。目前，人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)在很多宿主細(xì)胞中都得到表達(dá)，但用植物生產(chǎn)人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子時(shí)，表達(dá)水平很低，遠(yuǎn)未達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)要求。 人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子是一

2、種能夠刺激粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖、成熟和分化的糖蛋白。它是一種造血生長(zhǎng)因子，能提高機(jī)體的免疫能力，主要用于治療在骨髓移植、癌癥化療等過(guò)程中引起的白細(xì)胞減少病癥。hGM-CSF基因全長(zhǎng)2.5 kb，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子由144個(gè)氨基酸組成，其中前17個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，成熟hGM-CSF由127個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量約為16，293。 本研究選用在種子中特異表達(dá)的β-伴大豆球蛋白α'亞單位啟動(dòng)子，

3、在啟動(dòng)子下游插入煙草花葉病毒的5'非轉(zhuǎn)錄區(qū)(Ω序列)。對(duì)翻譯起始位點(diǎn)序列進(jìn)行改造，使之符合植物Kozak序列的特征。 本研究對(duì)hGM-CSF基因進(jìn)行人工改造，包括：①對(duì)hGM-CSF基因的信號(hào)肽進(jìn)行人工改造。用菜豆植物血球凝集素(PHA-E)的信號(hào)肽替換hGM-CSF的信號(hào)肽，PHA-E信號(hào)肽具有偏向植物氨基酸密碼子的特點(diǎn)，有助于提高基因的翻譯水平。②對(duì)hGM-CSF基因的末端進(jìn)行人工改造。hGM-CSF末端分別連接了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留

4、信號(hào)(KDEL)和貯藏囊泡靶向信號(hào)。KDEL四肽能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，避免蛋白受到蛋白酶的破壞，從而提高目標(biāo)蛋白的積累水平。在hGM-CSF基因的末端加上菜豆7S球蛋白(phaseolin)貯藏囊泡靶向信號(hào)(AFVY)，AFVY短肽能夠?qū)⒅亟M蛋白導(dǎo)向蛋白貯藏囊泡，提高種子中蛋白的積累。③對(duì)hGM-CSF基因的3'-非翻譯區(qū)進(jìn)行人工改造。在hGM-CSF基因的3'-非翻譯區(qū)插入人的7SL RNA Ⅳ區(qū)的44個(gè)核苷酸，7SL RNA Ⅳ

5、區(qū)能夠形成具有三個(gè)環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，與信號(hào)識(shí)別顆粒(SRP)中的蛋白亞基SRP54結(jié)合，是一種“天然”的適配體(aptamer)。將改造后的啟動(dòng)子和 hGM-CSF 基因構(gòu)建成表達(dá)載體pCAMBIA2300-CSF1 、pCAMBIA2300-CSF-KDEL 、pCAMBIA2300-CSF-AFVY、pCAMBIA2300-CSF-AP，轉(zhuǎn)化擬南芥。 本研究還探討了利用反義干擾技術(shù)來(lái)提高外源基因的表達(dá)可行性。利用擬南芥at2S2

6、基因本身的啟動(dòng)子和poly(A)信號(hào)，構(gòu)建含反義at2S2基因的表達(dá)載體pCAMBIA2300-CSF-KDEL-anti2S 和pCAMBIA2300-CSF-AFVY-anti2S，轉(zhuǎn)化擬南芥。 將構(gòu)建的pCAMBIA2300-CSF1、pCAMBIA2300-CSF-KDEL、pCAMBIA2300-CSF-AFVY 、pCAMBIA2300-CSF-AP 、pCAMBIA2300-CSF-KDEL-anti2S和pCAM

7、BIA2300-CSF-AFVY-anti2S表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，在含卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選。分別篩選出C(轉(zhuǎn)化pCAMBIA2300-CSF1)、KD(轉(zhuǎn)化pCAMBIA2300-CSF-KDEL)、AF(轉(zhuǎn)化pCAMBIA2300-CSF-AFVY)、AP(轉(zhuǎn)化pCAMBIA2300-CSF-AP)、KDS(轉(zhuǎn)化pCAMBIA2300-CSF-KDEL-anti2S)、AFS(轉(zhuǎn)化pCAMBIA2300-CSF-AFVY-anti2

8、S)轉(zhuǎn)基因株系50、32、28、6、7、9個(gè)。AP、KDS和AFS系列轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)部分植株種子敗育的現(xiàn)象，但仍有一部分植株得到后代并且能夠穩(wěn)定遺傳下去。 采用PCR擴(kuò)增初步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株。Southern雜交表明，AP、KDS、AFS系列的轉(zhuǎn)基因植株，雖然存在拷貝數(shù)的差異，但外源基因已經(jīng)整合到基因組中。對(duì)于AF和KD系列的轉(zhuǎn)基因單株，計(jì)算T2代分離比例，初步篩選出單拷貝的轉(zhuǎn)化株，再根據(jù)Southern雜交的結(jié)果，篩選出單拷貝轉(zhuǎn)

9、基因植株。對(duì)單拷貝的轉(zhuǎn)化株，用KD6轉(zhuǎn)化株作為花粉供體，分別與其他單拷貝的KD、AF轉(zhuǎn)化株進(jìn)行雜交。 取KD6轉(zhuǎn)化株根、莖、葉和授粉6天的種子，提取RNA，經(jīng)DNAaseⅠ處理后，用hGM-CSF基因特異引物進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果顯示，β-伴大豆球蛋白α'亞單位啟動(dòng)子在根、莖、葉中都沒(méi)有明顯的表達(dá)，在種子中特異表達(dá)。取KD6轉(zhuǎn)化株不同發(fā)育時(shí)期的種子，半定量RT-PCR表明，β-伴大豆球蛋白α'亞單位啟動(dòng)子在種子發(fā)育早期就開(kāi)始表達(dá)

10、，以后逐漸增強(qiáng)，到種子發(fā)育后期仍有很強(qiáng)的表達(dá)。 ELISA分析結(jié)果顯示，C系列轉(zhuǎn)基因植株未成熟莢中重組hGM-CSF蛋白含量低于0.01％，在hGM-CSF基因3'-末端加上導(dǎo)向信號(hào)后重組蛋白含量顯著提高。KD與AF系列轉(zhuǎn)基因植株的rhGM-CSF表達(dá)水平?jīng)]有顯著的差異。表明AFVY和KDEL信號(hào)都能夠顯著提高重組蛋白在種子中的積累。KD×KD6和AF×KD6雜交當(dāng)代種子EIASA結(jié)果表明，KD×KD6與AF×KD6雜交株當(dāng)代種子中顯示

11、出基因加性效應(yīng)，但AF×KD6雜交株基因加性效應(yīng)比KD×KD6明顯。取重組蛋白積累水平相近的KD1、AF18母本，分別與KD6雜交后，對(duì)雜交當(dāng)代種子中hGM-CSFmRNA定量分析表明，hGM-CSF mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異，但重組蛋白的積累水平差異顯著，表明AFVY和KDEL信號(hào)在重組蛋白篩選和運(yùn)輸途徑中獨(dú)立起作用。 AP系列轉(zhuǎn)化株的蛋白積累平均值比KD要高1倍以上，方差分析表明兩組平均值之間存在極顯著差異。對(duì)KD和AP系

12、列的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行hGM-CSF mRNA定量結(jié)果顯示，mRNA水平越高，重組蛋白積累水平就越高，表明hGM-CSF基因3'-非翻譯端插入7SL RNA Ⅳ區(qū)核苷酸對(duì)mRNA的穩(wěn)定起作用。 對(duì)KDS、AFS系列轉(zhuǎn)基因植株at2S2基因mRNA定量分析顯示，反義干擾顯著抑制at2S2基因的表達(dá)。SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果顯示，擬南芥種子中2S、12S-A和12S-B各個(gè)組分之間相對(duì)量無(wú)明顯變化。抑制at2S2基因表達(dá)并沒(méi)有改變種

13、子中主要沉降蛋白組分比。反義干擾的轉(zhuǎn)基因植株重組蛋白表達(dá)水平與KD、AF之間有極顯著的差異，表明抑制at2S2基因表達(dá)能夠提高重組hGM-CSF蛋白的積累，但hGM-CSF和atS2基因的mRNA定量分析表明，at2S2基因抑制程度與hGM-CSF基因表達(dá)水平之間并不存在線性關(guān)系。 Western雜交結(jié)果顯示，KD、AF和AP表達(dá)的重組hGM-CSF蛋白分子量大約在21 kDa左右，與轉(zhuǎn)基因煙草相似，比天然hGM-CSF分子量要