雞貧血病毒VP1、VP2基因在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)及產(chǎn)物免疫保護(hù)性研究.pdf

1、本研究根據(jù)GenBank已公布的CAV的VP1和VP2基因序列，利用Oligo6.0分子生物學(xué)軟件分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，從已構(gòu)建的載體pBluemCAV重組質(zhì)粒中分別擴(kuò)增出VP1及VP2基因，并將擴(kuò)增出的片段插入畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中，分別構(gòu)建成重組質(zhì)粒pPIC9K-VP1和pPIC9K-VP2，將構(gòu)建好的載體均用SalI線性化后，分別轉(zhuǎn)化給酵母SMD1168細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定、甲醇誘導(dǎo)表達(dá)、SDS-PAGE、Dot-Elisa和W

2、esternblot試驗(yàn)，結(jié)果表明：CAVVP1基因能夠分泌表達(dá)，在約50KD處出現(xiàn)特異帶，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測量，重組VP1蛋白在上清中的含量約為15μg/ml；VP2基因經(jīng)破碎酵母細(xì)胞，釋放胞內(nèi)蛋白，在約30KD處出現(xiàn)特異帶;經(jīng)凝膠分析儀分析，紫外分光光度計(jì)測量，VP2蛋白古酵母總蛋白的21％。表達(dá)蛋白量約為25μg/ml，均屬于高效表達(dá)。Dot-Elisa結(jié)果顯示被檢重組蛋白CAVVP1及CAVVP2都出現(xiàn)特異性顏色反應(yīng)應(yīng)；免疫印記

3、試驗(yàn)表明重組蛋白CAVVP1能夠與針對CAVVP1的單克隆抗體反應(yīng)，在50KD處出現(xiàn)特異帶，具有良好的反應(yīng)原性，重組蛋白CAVVP2與針對CAVVP1的單克隆抗體未見反應(yīng)。分別將重組CAVVP1、CAVVP2蛋白乳化后，免疫6周齡BALBB/c鼠，分離血清，Elisa試驗(yàn)結(jié)果顯示所得血清分別可以與全病毒反應(yīng)；IFA試驗(yàn)免疫重組蛋白CAVVP1制得的多克隆血清可以和感染CAV的MDCC-MSB1反應(yīng)，而VP2沒有反應(yīng)。 本研究優(yōu)化

4、了發(fā)酵條件與表達(dá)產(chǎn)量的關(guān)系，確定重組酵母表達(dá)CAVVP1及CAVVP2蛋白的最佳條件為：30℃，pH6.0，溶氧值40％，空氣流量1.25vvm，當(dāng)確定甘油耗盡時(shí)，通過分批補(bǔ)料的方式進(jìn)行甲醇補(bǔ)料，誘導(dǎo)表達(dá)，最終OD600可達(dá)到250或更高，通過比較不同溫度下保存重組蛋白的降解率得出表達(dá)蛋白保存于-20℃。這一工作為CAVVP1及CAVVP2蛋白的大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)和應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。 將發(fā)酵表達(dá)的重組蛋白CAVVP1、CAVVP

5、2經(jīng)薄層膠掃描、紫外分光光度計(jì)定量后，與等體積FREEJND’SADJUVANT(SIGMA公司)乳化后，分為對照組、CAVVP1、CAVVP1+CAVVP2三組，分別胸肌注射10日齡CAV陰性SPF雛雞，免疫前后均采血，分離血清，Elisa試驗(yàn)顯示免疫3周CAVVP1+CAVVP2組可檢測劍抗體，直到4周CAVVP1+CAVVP2組抗體滴度有所升高，5周達(dá)到最高滴度，6周后抗體滴度成平穩(wěn)趨勢，CAVVP1組3周可檢測到較低抗體，之后抗

6、體水平未見升高，對照組成陰性反應(yīng)；1FA試驗(yàn)結(jié)果表明CAVVP1+CAVVP2組免疫3周后可檢測到微弱的中和抗體，4周后可見較強(qiáng)熒光，CAVVP1組和對照組均未見到熒光。同時(shí)將乳化后的重組蛋白CAVVP1、CAVVP2分為對照組、CAVVP1、CAVVP1+CAVVP2三組，分別胸肌注射無免種雞，監(jiān)測血清及卵黃抗體滴度，Elisa結(jié)果顯示CAVVP1+CAVVP2組5周血清和卵黃抗體水平同時(shí)達(dá)到最高，之后波動較小，CAVVP1組及對照組