犬細小病毒VP2基因在畢赤酵母中的表達及其間接ELISA方法的初步建立.pdf

1、犬細小病毒病是由犬細小病毒(CPV)引起的犬的一種急性傳染病，以劇烈嘔吐、腹瀉和血液白細胞顯著減少、出血性腸炎和非化膿性心肌炎為主要特征。多發(fā)生于幼犬，病死率為10～100％，給世界各國養(yǎng)犬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。 CPV的中和抗原表位主要位于VP2上，VP2基因全長1755bp，編碼584個氨基酸，VP2蛋白是CPV的免疫原性蛋白，編碼CPV的主要抗原決定簇，可誘導機體產(chǎn)生中和抗體。 本研究根據(jù)GeneBank已發(fā)表的

2、CPVVP2基因序列，利用軟件Primer5.0設計并合成一對引物，通過IPCR擴增出1755bp的基因片段，將其克隆到T-easy載體，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pPICZαA-VP2，對其中的VP2進行序列測定，并將測序結(jié)果同CPV的其他幾個基因變異型：CPV-d(CPV-2)、CPV-15(CPV-2a)、CPV-39(CPV-2b)、CPV-31(CPV-2c)的VP2基因進行序列比較，核苷酸同源性分別為98.95％，98.85％，98

3、.75％，推導的氨基酸同源性分別為98.97％，98.75％，98.75％，經(jīng)PCR及雙酶切鑒定，目的基因正確插入pPICZαA轉(zhuǎn)座載體中，利用載體特異性引物5’AOX1/3’AOX1進行PCR鑒定，結(jié)果證實成功構(gòu)建重組pPICZαA-VP2。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，表達VP2蛋白分子量約為64.35KD，Western-bloting結(jié)果證實表達蛋白能夠被CPV陽性血清識別。ELISA結(jié)果證實本試驗獲得的VP2重組蛋白與CPV陽