傳染性法氏囊病病毒VP2基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及發(fā)酵工藝的最優(yōu)化.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是世界范圍內(nèi)尚未攻克的難題之一，該病能夠引起雞體的法氏囊組織發(fā)生萎縮，嚴(yán)重甚至出血，還導(dǎo)致雞體免疫抑制，一旦感染次病，就會(huì)出現(xiàn)大規(guī)模的雞群死亡。由于引起該病的傳染性法氏囊病毒(IBDV)經(jīng)常發(fā)生變異，很難控制該病的傳播，因此，世界各國科研人員紛紛就此病展開了研究。
　　本實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)部分，一部分是將IBDV的VP2基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行表達(dá)，另一部分確定最佳的發(fā)酵工藝。
　　(1)利用RT-PC

2、R技術(shù)將VP2蛋白的cDNA序列轉(zhuǎn)為VP2蛋白表達(dá)基因。
　　(2)將VP2基因連接到克隆質(zhì)粒PMD18-T上，構(gòu)成克隆載體PMD18-VP2。
　　(3)以PMD18-VP2為模版，用Premier5.0設(shè)計(jì)引物，將VP2基因轉(zhuǎn)入表達(dá)質(zhì)粒Ppicza上，構(gòu)建表達(dá)載體Ppicza-VP2。
　　(4)將表達(dá)載體Ppicza-VP2轉(zhuǎn)入畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)。
　　(5)，通過序列分析和酶切電泳確定VP2基因成功轉(zhuǎn)入克隆載

3、體、表達(dá)載體和酵母細(xì)胞內(nèi)。電泳圖顯示VP2基因長度為1.5kb，與理論相符。
　　(6)單因素實(shí)驗(yàn)確定影響誘導(dǎo)VP2蛋白表達(dá)的四個(gè)因素水平，確定最佳反應(yīng)溫度為28℃，最佳pH為4.0，最佳反應(yīng)轉(zhuǎn)速為190r/min，最佳誘導(dǎo)劑一甲醇添加量為3％。
　　(7)L9(33)正交試驗(yàn)確定誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的主導(dǎo)因素為誘導(dǎo)劑-甲醇的添加量，并確定最佳的因素配比即A2B3C2。
　　(8)用紫外分光光度計(jì)法測定VP2蛋白表達(dá)量為0.6