VP2互作蛋白CK1α及CSGalNAcT2在雞傳染性法氏囊病病毒復(fù)制中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、傳染性法氏囊?。↖nfectious Bursal Disease,IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus,IBDV）引起的急性、高度接觸性傳染病。該病主要侵害3-6周齡雛雞的中樞免疫器官—法氏囊，有人形象地稱該病為雞的―艾滋病。隨著IBDV的不斷進(jìn)化變異，先后出現(xiàn)了經(jīng)典毒株（classic IBDV,cIBDV）、變異毒株(variant IBDV,vIBDV)以及超強(qiáng)毒株(ve

2、ry virulent IBDV,vvIBDV)，vvIBDV的高致死率給世界養(yǎng)禽業(yè)帶了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，在流行病學(xué)研究不斷深入及反向遺傳學(xué)技術(shù)日趨成熟的基礎(chǔ)上，作為IBDV外層衣殼唯一組成成分的VP2蛋白，已被確認(rèn)為是決定病毒毒力及細(xì)胞嗜性差異的重要分子基礎(chǔ)。然而IBD發(fā)生與發(fā)展的實質(zhì)是IBDV與宿主細(xì)胞相互博弈的過程。盡管在病毒層面已表明VP2蛋白對IBDV的細(xì)胞嗜性和毒力有重要影響，然而VP2蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的具體作用依然還

3、不清楚。因此，深入了解VP2蛋白與宿主細(xì)胞的相互作用已成為目前揭開IBDV致病和免疫機(jī)制的研究重點。
　　本研究從病毒與宿主相互作用的角度，采用不同的蛋白相互作用技術(shù)，以VP2蛋白為誘餌篩選出與其相互作用的宿主蛋白，并進(jìn)一步探索它們在IBDV復(fù)制過程中的分子作用機(jī)制。首先，以免疫共沉淀技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，在感染IBDV的易感細(xì)胞DF1中，利用VP2蛋白的特異性單克隆抗體，鑒定出了一個互作候選蛋白酪蛋白激酶CK1α。免疫共沉淀及激

4、光共聚焦試驗進(jìn)一步證實，CK1α與VP2在IBDV感染過程中存在相互作用。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)在IBDV復(fù)制過程中，CK1α呈下調(diào)表達(dá)。基因表達(dá)調(diào)控實驗表明，CK1α下調(diào)表達(dá)能夠抑制IBDV復(fù)制，反之則促進(jìn)IBDV復(fù)制，另外CK1α激酶活性抑制劑D4476也會抑制IBDV復(fù)制，這表明CK1α對IBDV復(fù)制的影響與其激酶活性有關(guān)。綜上，CK1α在IBDV復(fù)制過程中的下調(diào)表達(dá)可能是宿主抵抗IBDV的一種抗病毒應(yīng)答。為深入揭示宿主通過下調(diào)CK1

5、α來限制IBDV復(fù)制的分子機(jī)制，我們經(jīng)過探索發(fā)現(xiàn)，IBDV感染能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-β，而CK1α過表達(dá)能夠拮抗IFN-β的抗病毒效應(yīng)，但這種拮抗作用不是源于對IFN-β本身表達(dá)量的負(fù)調(diào)控，而是源于對IFNAR1穩(wěn)定性的負(fù)調(diào)控。CK1α負(fù)調(diào)控IFNAR1穩(wěn)定性的具體機(jī)制是，CK1α能夠泛素化降解IFNAR1。IFNAR1的C端胞內(nèi)區(qū)存在一個保守的降解決定子序列，它與IFNAR1的泛素化密切相關(guān)，其磷酸化位點S545是CK1α發(fā)揮調(diào)控功能的

6、關(guān)鍵位點。點突變實驗證實，S545A的確能夠削弱CK1α介導(dǎo)的IFNAR1泛素化。IBDV感染宿主細(xì)胞的過程中，在發(fā)現(xiàn)CK1α下調(diào)的同時，也發(fā)現(xiàn)了IFNAR1在細(xì)胞膜表面上的分布增加。因此我們認(rèn)為，CK1α作為宿主的一種感應(yīng)分子，在IBDV感染后被下調(diào)，進(jìn)而通過負(fù)調(diào)控機(jī)制導(dǎo)致IFNAR1的上調(diào)，從而增強(qiáng)宿主限制IBDV復(fù)制的能力。
　　在宿主的抗病毒壓力下，病毒也進(jìn)化出多種機(jī)制來利用宿主細(xì)胞的資源而利于自身復(fù)制。本研究還鑒定了另一

7、個有利于 IBDV復(fù)制的宿主細(xì)胞蛋白—高爾基體膜蛋白硫酸軟骨素N-乙酰氨半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶（CSGalNAcT2）。CSGalNAcT2能夠與VP2蛋白在高爾基體上發(fā)生相互作用。結(jié)合基因芯片分析結(jié)果及熒光定量檢測結(jié)果，我們證實，CSGalNAcT2在IBDV感染過程中表達(dá)上調(diào)，而CSGalNAcT2上調(diào)表達(dá)能夠促進(jìn)IBDV的復(fù)制，且此種促進(jìn)作用依賴于高爾基體結(jié)構(gòu)的完整性。高爾基體是IBDV“復(fù)制工廠”核糖核蛋白復(fù)合體（RNP）的所在地，V