重組畢赤酵母產(chǎn)HSA-CP融合蛋白的發(fā)酵與提取.pdf

1、前胰島素C肽(CP)可抑制糖尿病并發(fā)癥，但因在體內(nèi)半衰期短，故將其與人血清白蛋白基因(HSA)融合，以延長CP藥物在體內(nèi)的半衰期。該融合基因在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)，獲得人血清白蛋白-前胰島素C肽融合蛋白，簡稱HSA-CP融合蛋白。針對(duì)含有HSA-CP融合基因的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris/HSA-CP)在BSM培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中，產(chǎn)HSA-CP融合蛋白量低、易被蛋白酶降解從而導(dǎo)致發(fā)酵液中

2、目的蛋白不易被分離純化等問題，本論文開展了如下研究:
　　 對(duì)Pichia pastoris/HSA-CP在搖瓶和發(fā)酵罐中的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，提高了HSA-CP融合蛋白產(chǎn)量。搖瓶培養(yǎng)條件下，2%濃度的甘油可使菌體細(xì)胞干重達(dá)10.64g/L，10g/L濃度的甲醇誘導(dǎo)72h得到52.97 mg/L的HSA-CP融合蛋白；7L發(fā)酵罐中對(duì)Pichiapastoris/HSA-CP進(jìn)行低密度培養(yǎng)，細(xì)胞干重最終為56.43 g/L，目的蛋

3、白產(chǎn)量達(dá)368.45mg/L；高密度培養(yǎng)時(shí)HSA-CP融合蛋白在發(fā)酵液中含量達(dá)到707.3mg/L，細(xì)胞干重最終為143.09 g/L。
　　 探索了減緩蛋白酶降解HSA-CP融合蛋白的方法。發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中存在內(nèi)切型蛋白酶對(duì)HSA-CP融合蛋白的降解作用，將目的蛋白降解成更小的蛋白片段。加入硫酸銨基本不會(huì)減弱蛋白酶對(duì)目的蛋白的降解；酪蛋白水解物能減緩蛋白酶對(duì)HSA-CP融合蛋白的降解；控制誘導(dǎo)溫度在26℃，搖瓶發(fā)酵液中蛋白酶活由3

4、0℃時(shí)的330.9 U/ml降至231.4U/ml，誘導(dǎo)時(shí)在添加1.5%濃度的酪蛋白水解物維持26℃誘導(dǎo)溫度的條件下，低密度發(fā)酵時(shí)蛋白酶活由511.4 U/ml降至442.2 U/ml，而上述方法對(duì)高密度發(fā)酵影響較小。
　　 確定了發(fā)酵液中的HSA-CP融合蛋白分離純化的主要步驟。超濾濃縮20倍，濃縮液中的HSA-CP融合蛋白含量可達(dá)7.04g/L，回收率為82.8%。DEAE Sepharose F.F.陰離子交換層析優(yōu)于Se