重組畢赤酵母生產(chǎn)堿性果膠酶的流加策略及工業(yè)化放大.pdf

1、堿性果膠酶(PGL)是指一類(lèi)在堿性環(huán)境中仍然具有較高活性的果膠酶。堿性果膠酶可作為一種天然助劑應(yīng)用于紡織品,纖維制品等的精煉處理工藝中,對(duì)作物表面的纖維質(zhì)和果膠質(zhì)等雜質(zhì)有一定的去除效果,同時(shí)對(duì)纖維素的損傷效果也不如堿法明顯。因此,若將以堿性果膠酶為主的生物酶精練工藝替代傳統(tǒng)的高溫高堿的化學(xué)工藝,不僅可減少環(huán)境污染嚴(yán)重和能耗較高等問(wèn)題,而且可提高棉織物和紡織品的質(zhì)地。
　　 本課題在前期的研究中已經(jīng)取得一定的成果:從自然環(huán)境中分離

2、篩選得到了一株高產(chǎn)堿性果膠酶的枯草芽胞桿菌Bacillus sp.WSHB04-02。之后利用分子克隆技術(shù),將PGL的基因成功地表達(dá)于畢赤酵母GS115中;隨后又通過(guò)高密度發(fā)酵和低溫誘導(dǎo)發(fā)酵等策略,使PGL的產(chǎn)量有了大幅度的提高。在此基礎(chǔ)上,本論文通過(guò)詳盡分析了在菌體誘導(dǎo)期,利用混合碳源流加對(duì)重組Pichia.pastoris GS115高效表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)山梨醇與甲醇的混合添加對(duì)PGL產(chǎn)量的提高作用較為明顯;通過(guò)對(duì)細(xì)胞死亡率,胞內(nèi)醇氧

3、化酶和蛋白酶降解作用等研究進(jìn)一步分析了山梨醇在提高PGL的產(chǎn)量時(shí)所起的作用。在此基礎(chǔ)上,本研究又完成了堿性果膠酶發(fā)酵生產(chǎn)的初步放大和中試研究,即從3 L,30 L,1000 L,到5000 L的逐級(jí)放大過(guò)程。主要研究結(jié)果如下:
　　 1為提高重組畢赤酵母生產(chǎn)堿性果膠酶(PGL)的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度,在誘導(dǎo)期采用多種碳源與甲醇混合添加的模式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):甘油、山梨醇、乳酸與甲醇的混合添加均可以提高PGL的產(chǎn)量,其中山梨醇與甲醇的混合

4、流加效果最為顯著。研究表明,當(dāng)以一個(gè)合適的流速添加山梨醇,甘油和乳酸等碳源時(shí),堿性果膠酶的產(chǎn)量可以明顯得到提高。而由于胞內(nèi)啟動(dòng)子并沒(méi)有被抑制,即其對(duì)應(yīng)的醇氧化酶的活力沒(méi)有被削弱,進(jìn)而使畢赤酵母表達(dá)外源蛋白效率提高,且山梨醇對(duì)堿性果膠酶產(chǎn)量的提高較為明顯。當(dāng)山梨醇的流速為3.6g(H·L)時(shí),PGL酶活可達(dá)1593 U/mL,生產(chǎn)強(qiáng)度為16.7 U/(mL·h),比對(duì)照分別提高了84.6％和45.2％,實(shí)現(xiàn)了堿性果膠酶的高效生產(chǎn)。

5、　　 2在之前的研究中發(fā)現(xiàn)了山梨醇和甲醇混合添加的方式可以顯著提高PGL的產(chǎn)量,當(dāng)山梨醇的流速為3.6 g/(h·L)時(shí),PGL酶活可達(dá)1593 U/mL。為了從機(jī)理上研究PGL產(chǎn)量提高的原因,本實(shí)驗(yàn)主要考察了以下幾個(gè)參數(shù)指標(biāo)的變化:首先山梨醇的添加顯著降低了細(xì)胞死亡率,在誘導(dǎo)90 h以后,細(xì)胞死亡率從25％降低為9％左右;其次,3.6 g/(h·L)的山梨醇流速不但不會(huì)抑制啟動(dòng)子的表達(dá),甚至有一定的促進(jìn)作用,胞內(nèi)醇氧化酶AOX的酶活

6、為6.9 U/g(對(duì)照為5.7 U/g);第三,由于細(xì)胞死亡率的降低,一定程度上削弱了由于細(xì)胞死亡而向胞外釋放蛋白酶的過(guò)程,進(jìn)而降低了蛋白酶對(duì)PGL的分解作用。所以我們認(rèn)為在畢赤酵母表達(dá)體系中,山梨醇和甲醇的混合流加對(duì)于提高外源蛋白的產(chǎn)量有著明顯的促進(jìn)作用。
　　 3為實(shí)現(xiàn)堿性果膠酶的工業(yè)化生產(chǎn),進(jìn)行了不同反應(yīng)器規(guī)模的放大研究,完成了從3L、30 L、1000 L至5000 L發(fā)酵罐的逐級(jí)放大。在克服了溶氧,傳質(zhì)等限制性問(wèn)題以后