重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)類人膠原蛋白Ⅱ工藝研究.pdf

1、類人膠原蛋白Ⅱ(human—like collagenⅡ，簡HLCⅡ)是膠原蛋白族的系列衍生物之一，其生物學(xué)性能良好，可以促進上皮細胞和軟骨細胞生成，還具有止血功能，且機械性能良好。真空冷凍干燥后質(zhì)地較硬，室溫條件下具成膠性，且膠體性質(zhì)不易發(fā)生改變，適合做人工皮膚、人工血管、手術(shù)縫合線、人工骨等醫(yī)用材料。 本文在本實驗室成功構(gòu)建的重組大腸桿菌基礎(chǔ)上，對分批—補料培養(yǎng)生產(chǎn)類人膠原蛋白II的發(fā)酵條件進行了研究，主要考察了培養(yǎng)溫度、

2、pH、溶氧控制條件、比生長速率和誘導(dǎo)條件五個方面對細胞生長和類人膠原蛋白Ⅱ表達的影響，結(jié)果表明： 1．重組大腸桿菌最適生長pH為6.5，類人膠原蛋白Ⅱ最適表達pH為6.8，采取分階段pH控制方式，即誘導(dǎo)前控制pH6.5，誘導(dǎo)后控制pH6.8，與恒定pH控制相比，不僅適于菌體生長，而且有利于類人膠原蛋白Ⅱ的高效表達，細胞密度為82.3 g·L-1，類人膠原蛋白Ⅱ濃度10.8 g·L-1。 2．初始培養(yǎng)溫度為34℃，類人

3、膠原蛋白Ⅱ濃度為11.8 g·L-1。說明適當降低工程菌的培養(yǎng)溫度有利于外源蛋白的表達。 3．溶解氧濃度控制在20％時，蛋白表達率高，而且不會造成菌體的氧中毒。在此基礎(chǔ)上可以采取分階段供氧模式，即誘導(dǎo)前控制20％，誘導(dǎo)后控制在40％，可以提高類人膠原蛋白Ⅱ表達量，發(fā)酵結(jié)束后，細胞密度和類人膠原蛋白Ⅱ濃度分別為83.5 g·L-1和12.2 g·L-1。 4．誘導(dǎo)前后，比生長速率對細胞生長和類人膠原蛋白Ⅱ表達的影響是不

4、同的：誘導(dǎo)前，控制比生長速率在0.20-0.25 h-1，誘導(dǎo)后，控制比生長速率在0.05-0.06 h-1，發(fā)酵結(jié)束后，細胞密度和類人膠原蛋白Ⅱ濃度分別為13.2 g·L-1和83.9 g·L-1。 5.誘導(dǎo)時機應(yīng)該控制在細胞對數(shù)生長后期，類人膠原蛋白Ⅱ的表達量達到14.5 g·L-1，高于在對數(shù)生長中期和中后期進行誘導(dǎo)時類人原蛋白Ⅱ的產(chǎn)量；采取34℃培養(yǎng)10 h后降溫至30℃培養(yǎng)，至對數(shù)生長后期升溫至42℃誘導(dǎo)3h后，降溫